İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Pirofosfokinaz, adenozin trifosfat, ATP gibi nükleotid öncüsünden guanozin difosfat, GDP gibi substrata difosfat veya pirofosfat transferini katalize eder. Bu, önemli bir sinyal molekülü olan guanozin tetrafosfatı oluşturur.

Pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için, magnezyum klorür ile desteklenmiş uygun bir tampon içinde GDP'leri ve radyoaktif işaretli ATP'leri içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyon karışımına istenen miktarda pirofosfokinaz ekleyin ve inkübe edin.

Zamanla, magnezyum iyonlarının varlığında, pirofosfokinaz, radyoaktif işaretli pirofosfat parçasını ATP'den GDP'ye aktarmaya başlar ve radyoaktif guanozin tetrafosfat üretir.

Şimdi, katyonik polimer bazlı sabit bir faz olan polietilenimin-selüloz ile önceden kaplanmış ince bir tabaka kromatografisi veya TLC plakası alın. Reaksiyonu durdurmak ve ilerlemeyi değerlendirmek için reaksiyon karışımı analitlerinin TLC plaka tabanının yakınında farklı zaman noktalarında alikotlarını tespit edin.

Plakayı, mobil fazlı bir çözücü olan monobazik potasyum fosfat içeren bir cam hazneye daldırın. Çözücü cephesi yukarı doğru hareket ettikçe, negatif yüklü analitler, pozitif yüklü durağan faz ile olan afinitelerine bağl