İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Pirofosfokinaz, adenozin trifosfat, ATP gibi nükleotid öncüsünden guanozin difosfat, GDP gibi substrata difosfat veya pirofosfat transferini katalize eder. Bu, önemli bir sinyal molekülü olan guanozin tetrafosfatı oluşturur.

Pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için, magnezyum klorür ile desteklenmiş uygun bir tampon içinde GDP'leri ve radyoaktif işaretli ATP'leri içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyon karışımına istenen miktarda pirofosfokinaz ekleyin ve inkübe edin.

Zamanla, magnezyum iyonlarının varlığında, pirofosfokinaz, radyoaktif işaretli pirofosfat parçasını ATP'den GDP'ye aktarmaya başlar ve radyoaktif guanozin tetrafosfat üretir.

Şimdi, katyonik polimer bazlı sabit bir faz olan polietilenimin-selüloz ile önceden kaplanmış ince bir tabaka kromatografisi veya TLC plakası alın. Reaksiyonu durdurmak ve ilerlemeyi değerlendirmek için reaksiyon karışımı analitlerinin TLC plaka tabanının yakınında farklı zaman noktalarında alikotlarını tespit edin.

Plakayı, mobil fazlı bir çözücü olan monobazik potasyum fosfat içeren bir cam hazneye daldırın. Çözücü cephesi yukarı doğru hareket ettikçe, negatif yüklü analitler, pozitif yüklü durağan faz ile olan afinitelerine bağlı olarak göç etmeye başlar.

Farklı fosforile analitlerin negatif yüklerindeki ve ağırlığındaki farklılıklar, TLC plakası üzerindeki nispi göçlerini belirleyerek, farklı bantlar olarak hareketsiz hale gelmelerine izin verir.

Solvent cephesi istenen mesafeye ulaştığında, plakayı çıkarın ve havayla kurutun. Pirofosfokinaz aktivitesini analiz etmek için radyoaktif olarak etiketlenmiş ATP tükenmesine ve guanozin tetrafosfat birikimine karşılık gelen radyoaktif sinyal yoğunluğunu ölçün.

Reaksiyonu gerçekleştirmeden önce, PEI-selüloz ince tabaka tabaka kromatografi plakalarını deiyonize suda yıkayarak hazırlayın. Plakaları yaklaşık 0,5 santimetre derinliğe kadar çift damıtılmış su içeren bir cam hazneye yerleştirin. Suyun plakanın üstüne geçmesine izin verdikten sonra, plakaları cam hazneden çıkarın ve gece boyunca kuruması için bir tezgah üstü rafta bırakın.

Numunelerin TLC için nereye uygulanacağını belirtmek için kuru plakaları bir kenardan 2 santimetre yumuşak bir kalemle işaretleyin. 2 mikrolitrelik numuneler için, numuneleri en az 1 santimetre aralıklarla uygulayın. Deneyleri planlarken, numune miktarının belirlenmesi için boş bir şerit görevi görmesi için her plakada her zaman kullanılmayan bir nokta bırakın.

Enzim aktivitesi testini gerçekleştirmek için, metin protokolünde açıklandığı gibi ^γ-32P-ATP kullanarak bireysel reaksiyonlar hazırlayın. Nükleotid içeren karışıma RSH eklenmesi enzimatik aktivite testini başlattığından, diğer bileşenler karıştırıldıktan sonra RSH'yi ekleyin.

Kirletici nükleaz aktivitesinden kaynaklanan ATP hidrolizini kontrol etmek için, protein içermeyen 10 mikrolitrelik bir reaksiyon oluşturun ve paralel olarak inkübe edin. T = 0'da 2 mikrolitrelik numuneleri belirleyin ve deneyin sonunda ATP'nin protein yokluğunda hidrolize olmadığından emin olun.

RSH eklendikten hemen sonra, 2 mikrolitreyi çıkarın ve t = 0 dakikalık numune olarak etiketli PEI-selüloz plakaya yerleştirin.

Reaksiyonu 37 santigrat derecede inkübe edin, istenen zaman noktalarında 2 mikrolitre alikotu çıkarın. Tüm alikotlar toplandıktan sonra, kromatografi odasını 1.5 molar monobazik potasyum fosfat ile 0.5 santimetre derinliğe kadar doldurarak ince tabaka kromatografisi yapın. Plakanın alt kenarını çözücüye batırın ve çözücünün yaklaşık 90 dakika boyunca plakanın üstüne geçmesine izin verin.

Plakayı kromatografi tankından çıkarın ve gece boyunca havayla kuruması için bir tezgah üstü kurutma rafına yerleştirin. Plaka kuruduktan sonra, radyoaktif materyalin görüntüleme kasetine aktarılmasını önlemek için plakayı plastik filme sarın ve otoradyografi ile analiz edin.

Ayrılmış reaksiyonlar içeren PEI-selüloz plakayı oda sıcaklığında dört saat boyunca bir fosfor görüntüleyici kasetine maruz bırakın. Pozlamanın ardından kaseti bir fosfor görüntüleyicide görüntüleyin.

Grafiksel kullanıcı arabirimine sahip görüntüleme yazılımı kullanarak, önce "Dikdörtgen çiz"i seçerek ilgi alanlarını veya ROI'leri çizin. Ardından, fareyi kullanarak tüm bir şeridin etrafına dikdörtgen ROI'ler ve bu şeritte bulunan ATP ve guanozin tetrafosfat noktalarını çizin.

"Seç, Kopyala ve Yapıştır" komutlarını kullanarak diğer şeritlerde aynı ROI'leri çizin ve ROI'lerin her şeritte aynı alanlardaki sinyalleri ölçtüğünden emin olun. Boşluk olarak kullanılmak üzere kullanılmayan bir şeritten ROI'leri dahil edin.

"Analiz Et | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi | Görüntüleme yazılımının "komutlarını ekle", PEI-selüloz plaka üzerine çizilen tüm ROI'leri seçin. Şimdi, "Analiz Et | Set Ölçümleri | Her bir ROI içindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek için "Ölç" komutlarını kullanın ve ölçümleri bir elektronik tablo olarak dışa aktarın. Elektronik tabloda, deneysel sinyallerden boş ROI değerlerini çıkarın.