Headspace Gaz Kromatografisi: Zebra Balığı Embriyolarında Etanol Konsantrasyonunu Değerlendirme Tekniği

Uçucu bir organik bileşik olan etanolün konsantrasyonunu analiz etmek için, homojenize etanol ile muamele edilmiş zebra balığı embriyo kültürü süpernatantını bir kromatografi şişesinde alarak başlayın. Süpernatant, etanole ek olarak diğer uçucu olmayan organik bileşikleri içerir. Kapalı şişeyi kromatografi düzeneğinin bir örnekleyici ünitesine yerleştirin ve uygun bir sıcaklıkta ısıtın.

Isıtma sırasında, etanol buharlaşır ve uçucu olmayan kalıntıları geride bırakarak gaz fazına veya üst boşluğa geçer. Bu, örnekleyicinin gaz halindeki etanolü sürekli bir taşıyıcı gaz akışına sokmasına izin verir. Bu bir mobil faz görevi görür.

Etanol, sıvı sabit fazın paketlenmiş bir yatağını içeren önceden ısıtılmış sarmal kromatografi kolonundan geçer. Uçuculukları ve polariteleri nedeniyle, hareket eden etanol molekülleri, kendilerini sabit faza bölerek sabit faz parçacıkları üzerinde adsorbe olmaya başlar.

Yüksek kolon sıcaklığı nedeniyle, etanol moleküllerinin adsorpsiyonu kararsız ve geçicidir, bu da bu moleküllerin taşıyıcı gaz akışı boyunca kademeli olarak desorbe olmasına ve göç etmesine izin verir. Bu etanol molekülleri, kolon uzunluğu boyunca bir dizi adsorpsiyon-desorpsiyon olayına uğrar.

Daha sonra etanol, elde edilen kromatogramda eğrinin altındaki alana karşılık gelen numunedeki konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olan bir algılama odasına girer.

50 mikrolitreye ayarlanmış iki p200 mikropipet kullanın ve proteaz kokteyl solüsyonunu birine aspire edin ve ikincisine su ekleyin. Ardından, 10 embriyoyu bir cam pipet kullanarak 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne hızlı bir şekilde yerleştirin ve kapağı kapatın. Test edilecek tüm numuneler, kontroller ve etanol ile muamele edilen embriyolar için bu işlemi tekrarlayın.

Her seferinde bir örnekle çalışarak, kapağı hızlı bir şekilde açın ve tüm kalıntı embriyo ortamını 200 mikrolitreye ayarlanmış bir p200 mikropipet ile aspire edin. Hızlı ama nazikçe 50 mikrolitre su ekleyin ve çıkarın, ardından 50 mikrolitre proteaz kokteylini ekleyin ve tüp kapağını kapatın.

Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından hızlı bir şekilde 450 mikrolitre 5 Molar sodyum klorür ekleyin ve tüp kapağını kapatın. Numuneyi 10 dakika girdaplayarak homojenize edin ve 2 mikrolitre süpernatanı bir gaz kromatografi şişesine aktarın. Şişeyi bir politetrafloroetilen kapakla kapatın.

Başlatma yöntemini tamamladıktan sonra, 436 Akım spme etanol 2013 3 dakikalık emme 2_5min rg çalıştırmasını yükleyin. Numune listesindeki her numune için analiz yazılımındaki Yöntemler menüsünden METH. Hava, su ve 5 Molar sodyum klorür proteaz kokteyl boşluklarından başlayarak numune listesini doldurun. Ardından, etanol standartlarını 0.3125 ila 40 milimolar arasında sırayla girin.

İkinci tur boşluklarla standartları takip edin. Test edilecek tüm homojenize embriyo süpernatan numunelerini, en düşükten en yüksek tahmin edilen etanol konsantrasyonuna kadar girin ve üçüncü bir boşluk turu girerek bitirin.

Gaz kromatografi şişelerini, numunelerin girildiği sırayla otomatik numune alma cihazına ekleyin ve 10 ila 15 dakika ısınmalarına izin verin. Ardından, yazılımı kullanarak örnek çalıştırmaları başlatın. Tüm çalıştırmalar tamamlandıktan sonra, örnek listesine son bir örnek ekleyerek ve bekleme modunda çalıştırarak kapatma yöntemini etkinleştirin. METH. Örnek çalıştırması sırasında alınan tüm verileri yedekleyin.

Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra, Kromatogramı Aç'a tıklayın ve sonuçların bulunduğu klasörü açın. Örnekler bu programa otomatik olarak entegre edilir. Sonuçlarda, doğru tepe noktalarının entegre edildiğinden emin olun. Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.

Etanol standartlarının tepe yüksekliğini bir grafik üzerinde çizin. Ardından eğim, Y-kesişim noktası ve R-kare değerlerini hesaplayın. Standartların Y-kesişim noktasından numunenin tepe yüksekliğini çıkararak ve bu değeri standartların eğimine bölerek her numune için etanol değerini elde edin.

Embriyolardaki etanol konsantrasyonunu hesaplamak için, her numune için seyreltme faktörünü hesaplayın ve numune etanol değerini bu seyreltme faktörü ile çarpın. Son olarak, ortam etanol değerini 10'luk bir seyreltme faktörü ile çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın.