JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:15 dk • July 8th, 2025
Heparan sülfatlar, HS'ler gibi sülfatlanmış glikozaminoglikanlar, hücre yüzey proteinlerine bağlı, değişken zincir uzunluklarına sahip, negatif yüklü, doğrusal, sülfatlanmış polisakkaritlerdir.
Fare akciğer dokusundan izole edilen farklı uzunluktaki HS'leri tahmin etmek için jel kaset montajı ile başlayın. Kısmen, katalizör maddeler - amonyum persülfat ve tetra-metil-etilen-diamin dahil olmak üzere yüksek konsantrasyonlu akrilamid-bisakrilamid çözeltisi ile doldurun. Polimerizasyonu engelleyebilecek hava temasını önlemek için su ile kaplayın. Kuluçkaya yatmak.
Katalizör ajanlar, küçük gözenekli çözünen jel oluşturan akrilamid-bisakrilamid polimerizasyonunu indükler. Suyu atın. Katalizör ajanlarla düşük konsantrasyonda akrilamid-bisakrilamid çözeltisi ekleyin. Kuyucuklar oluşturmak için bir jel tarak yerleştirin. Çözelti polimerize olur ve geniş gözenekli istifleme jeli oluşturur.
Elektroforez sırasında optimum elektrik iletkenliği için elektroforez tankının odalarını çalışan tampon ile doldurun.
HS karışımını, izleme boyası ve sükroz içeren yükleme tamponunda çözün. Daha sonra, bu karışımı ve standart HS merdivenlerini kaset kuyularına aktarın. Sükroz karışımı kuyucuklarla sınırlar. Boya, elektroforez ilerlemesini izlemeye yardımcı olur.
Düşük voltajda elektroforezi başlatın. Negatif yüklü HS'ler, pozitif yüklü anoda doğru hareket ederek istifleme jelini geçer ve gözenek boyutu farkı nedeniyle istifleme-çözme jeli arayüzünde konsantre olur.
Voltajı arttırın. Küçük zincirli HS'ler, çözücü jel boyunca hızlı bir şekilde hareket ederek daha uzağa hareket ederken, uzun zincirli HS'ler jel matrisi içinde sıkışıp kalır ve yavaş hareket eder.
Elektroforez sonrası jeli boyayın. HS'ler, küçük zincirli HS'lerin uzun zincirli HS'lerden daha düşük konumlandırıldığı farklı bantlar olarak görünür. Bireysel HS'lerin uzunluğu, HS standartları ile karşılaştırılarak belirlenebilir.
PAGE tankına boş bir kaset yerleştirerek başlayın. 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre çözücü jel çözeltisini 60 mikrolitre taze hazırlanmış% 10 amonyum persülfat ile karıştırarak çözme jelini dökün. Daha sonra 10 mikrolitre TEMED ekleyin. Tüpü nazikçe 2 ila 3 kez ters çevirin.
Bir pipet kullanarak kasete hızlı bir şekilde 10 mililitre aktif poliakrilamid jel çözeltisi ekleyin. 2 mililitre deiyonize filtrelenmiş su ile kaplayın ve çözünen jelin 30 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin.
Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, üzerine binen suyu atın. 15 mililitrelik bir tüpte 3 mililitre istifleme jeli çözeltisini 90 mikrolitre taze hazırlanmış% 10 amonyum persülfat ile karıştırarak istifleme jelini dökün. Daha sonra 3 mikrolitre TEMED ekleyin ve tüpü 2 ila 3 kez nazikçe ters çevirin.
Kaset ağzına kadar dolana kadar istifleme jeli solüsyonunu katılaşmış çözünen jelin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın. Boş poliakrilamid jel kasetiyle birlikte verilen tarağı tamamen yerleştirin ve istifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasına izin verin. Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridini kasetin altından çıkarın ve kaseti tekrar PAGE tank tertibatına yerleştirin. Üst ve alt bölmeleri ilgili tampon çözeltileriyle doldurun.
Kurutulmuş glikozaminoglikan örneklerini gerekli minimum hacimde deiyonize edilmiş, filtrelenmiş su içinde çözün ve 1'e 1 oranında örnek yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri ve HS oligosakkarit merdivenlerini jelin içine yükleyin.
Jeli 100 voltta 5 dakika tekrar çalıştırın. Ardından, çözünen jel çözeltisinin akrilamid yüzdesine bağlı olarak 200 ila 100 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın.