JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:10 dk. • July 8th, 2025
Protein örneğini bir deterjan - sodyum dodesil sülfat, SDS ve bir indirgeyici ajan - beta-merkaptoetanol içeren bir denatüre edici tampon ile muamele ederek başlayın. Kısa bir süre ısıtın. Bu adım sırasında, beta-merkaptoetanol disülfid bağlarını bozarak proteine katlanmamış bir konformasyon sağlar.
Katlanmamış proteinler, maruz kalan hidrofobik amino asitleri ile negatif yüklü SDS'ye bağlanır ve düzgün bir negatif yük kazanır. Gerçek zamanlı görselleştirme için örneğe uygun bir izleme boyası ekleyin.
Şimdi, numuneyi ve standart moleküler boyut işaretleyicisini, daha düşük konsantrasyonda çapraz bağlı akrilamid polimerleri içeren poliakrilamid jelin üst tabakası olan istifleme jelinde bulunan ayrı kuyucuklara yükleyin.
Tampon dolgulu jel aparatını güç kaynağına bağlayın.
Bir elektrik alanının varlığında, negatif yüklü proteinler anoda doğru serbestçe hareket eder ve daha yüksek konsantrasyonlu bir jel içeren alt katman olan çözünen jele girmek için bir araya gelir.
Çözünen jelde, proteinler moleküler boyutlarına göre göç etmeye başlar, daha küçük proteinler hızla göç eder ve bu da optimal şekilde çözülmüş protein bantları ile sonuçlanır. Daha sonra, çalışmayı durdurun ve jeli çıkarın.
Jeli, proteinlerdeki bazik amino asitlere elektrostatik olarak bağlanan ve onlara mavi renk veren anyonik bir boya olan Coomassie mavisi ile boyayın. Daha sonra, daha iyi görselleştirme için jeli asetik asit çözeltisinde lekeleyin.
Jeli çıkarın ve ayrılan proteinleri tahmini moleküler ağırlıklarına göre tanımlayın.
Metin el yazmasında anlatıldığı gibi iki ayırıcı jel hazırlayın. Jeli 1 mililitrelik bir pipet kullanarak cam plakaların arasına dökün ve üst 2 santimetrenin karışımdan arınmış olduğundan emin olun. Ayırma jelinin üzerine% 70 etanol ekleyin ve iki katman arasında eşit bir arayüz oluşturun.
Ayırma jelleri polimerize olduktan sonra, metin el yazmasındaki talimatları kullanarak istifleme jellerini hazırlayın. Ardından, etanolü ayırma jellerinden çıkarın ve istifleme jeli çözeltisini ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan istenen sayıda cebe sahip bir tarağı dikkatlice yerleştirin ve jelin 20 ila 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
Her numuneden 4 mikrolitre ve protein merdivenini ayrı kuyucuklara yükleyin. Daha sonra jeli Tris-Glycine çalışma tamponunda 144 voltta oda sıcaklığında 45 dakika çalıştırın. Jelleri bir külbütör üzerinde 30 dakika boyunca lekelemek için önceden ısıtılmış Fairbanks çözeltisi A'yı ve istenen arka plan elde edilene kadar bir külbütör üzerindeki jellerin rengini gidermek için önceden ısıtılmış Fairbanks çözelti D'yi kullanın.