JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 5:34 dk • July 8th, 2025
Başlamak için, üre içeren yükleme boyası ile karıştırılmış floresan etiketli fosforile ve fosforile edilmemiş RNA oligonükleotidleri içeren bir numune alın. Numuneyi ısıtın.
Üre - güçlü bir denatüran - ısı ile kombinasyon halinde ikincil RNA yapısını denatüre eder, bu da doğrusallaştırılmış ve yapılandırılmamış konformasyonu ile sonuçlanır. Şimdi, akrilamid-bisakrilamid çözeltisini üre ile karıştırarak jeli dökün.
Sonraki jel polimerizasyonunu kolaylaştırmak için bir katalizör olan tetrametilen diamin ve oksitleyici bir ajan olan amonyum persülfat ekleyin.
Çözeltiyi önceden monte edilmiş bir kaset aparatına dökün. Numune yüklemesi için kuyucuklar oluşturarak bir tarak yerleştirin. Jelenin polimerize olmasına izin verin. Kaseti jel aparatının içine yerleştirin. Üst ve alt rezervuarlara çalışan bir tampon ekleyin ve tüm jel boyunca akım akışını koruyun. Tarağı çıkarın.
Görselleştirme boyası ile karıştırılmış numuneyi kuyuya yükleyin ve jeli istenen voltajda bir güç kaynağına bağlayın. Jeldeki üre, RNA moleküllerinin doğrusal türler olarak göç etmesine izin verir.
Jel, negatif yüklü RNA moleküllerinin gözeneklerden pozitif elektrota doğru hareket etmesine izin veren bir elek görevi görür. Çalışma sırasında, doğası gereği daha negatif olan fosforile RNA, fosforile olmayan RNA'dan daha hızlı hareket eder.
Floresan etiketli RNA'nın tespiti için jeli görüntüleyin. Fosforile edilmemiş RNA ile karşılaştırıldığında daha düşük bir bant olarak görünen daha hızlı göç eden fosforile RNA arasındaki hareketlilik değişimini gözlemleyin.
% 15 denatüre edici akrilamid jel çözeltisi hazırlamak için, 22.5 mililitre önceden karıştırılmış %40 29: 1 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi, 6 mililitre 10X TBE, 28.8 gram üre ve RNaz içermeyen suyu toplam 59 mililitre hacme kadar birleştirin. Ardından, çözeltiyi yavaşça karıştırın.
Çözeltiyi mikrodalgada 20 saniye ısıtın, karıştırın ve hemen 20 saniye daha mikrodalgaya geri koyun. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi yavaşça karıştırın. Cam kabı 5 dakika boyunca soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirin ve cam kabı çevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabının içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun. Çözelti soğuduğunda, partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını gidermek için 0,22 mikrometre tek kullanımlık filtreleme ünitesi ile filtreleyin ve gazını alın.
Kısa ve uzun bir cam tabağı sabun ve suyla yıkayın. Ardından, her bir plakaya %95 etanol püskürtün ve nemi gidermek için camı silin. Uzun plakayı bir kutunun üzerine yerleştirerek tezgahın üstünden kaldırın. Ardından, plakanın uzun kenarları boyunca 0,4 milimetrelik ara parçaları yerleştirin. Kısa plakayı, uzun plakanın ve ara parçaların kenarlarının hizalandığından emin olarak uzun plakanın üzerine yerleştirin. Ardından, her iki tarafı eşit aralıklı üç metal kelepçe ile sıkıştırın.
Akrilamid çözeltisine 24 mikrolitre TEMED ekleyin ve karıştırın. Daha sonra 600 mikrolitre% 10 APS ekleyin ve çözeltiyi hemen cam plakalar arasına dökün.
Akrilamid çözeltisini cam plakalı sandviç arasına dökmek gerçekten zor olabilir. Hava kabarcıklarını önlemek için, solüsyonunuzu dökerken cam tabaklı sandviçe hafifçe vurun.
Dikkatlice, cam plakalı sandviçin üstüne 32 oyuklu temiz bir tarak ekleyin ve akrilamidin 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
Jeli çalıştırmak için ısı bloğunu 75 santigrat dereceye ayarlayın, metal kelepçeleri çıkarın ve cam plakalı sandviçi iyice yıkayın ve kurulayın. Plakalı sandviçi, kısa plaka öne bakacak şekilde jel aparatına yerleştirin ve 100 mililitre 10X TBE ile 1,9 litre RNaz içermeyen suyu birleştirerek 0,5X TBE çalışma tamponu hazırlayın.
Aparatın üst ve alt bölmelerine 600 mililitre çalışma tamponu ekleyin. Tarağı jelden yavaşça çıkarın ve kuyuları bir şırınga ile iyice durulayın. Jeli 30 dakika boyunca 50 watt'ta önceden çalıştırın. Ardından kuyuları tekrar durulayın.
Söndürülmüş reaksiyonları nabız döndürün ve 3 dakika boyunca 75 santigrat derecede inkübe edin. Darbe dönüşünü tekrarlayın ve hemen her numuneden 10 mikrolitre jelin üzerine yükleyin. Ardından, jeli 50 watt'ta 3 saat çalıştırın. Çalışma bittiğinde, güç kaynağını kapatın ve cihazın üst haznesini boşaltın.
Cam plakalı sandviçin dış tarafını yıkayın ve kurulayın. Ardından, folyo ile örtün ve görüntüleme için bir lazer tarayıcıya aktarın. Cam plakalı sandviçi lazer tarayıcının tablasına monte edin, istenen florofor için uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın ve jeli görüntüleyin.