Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Multimerik protein kompleksleri, çeşitli biyolojik süreçler için gereklidir.

Protein komplekslerini doğal hallerinde multimer-PAGE ile ayırmak için, istenen kompleksleri içeren doku lizatını alın. Lizatı Blue native PAGE için bir jel düzeneğine yükleyin.

Sistemi mavi anyonik boya içeren alkali bir çalışma tamponu ile doldurun ve güç kaynağına bağlayın. Alkali bir pH'ta, boya molekülleri protein kompleksine bağlanır ve ona denatüre etmeden genel bir negatif yük verir. Bu negatif yüklü, bozulmamış protein kompleksi, jelden mavi bir bant olarak geçer.

Minimal bir çalışmanın ardından ve bozulmamış proteinin çözünen jele geçmesine izin vererek, kompleksi içeren şeridi çıkarın. Şeridi, reaktif gruplarının proksimal proteinin amin grupları ile etkileşime girmesine izin vermek için çapraz bağlama maddesi içeren bir çözelti içinde inkübe edin ve multimerik kompleksi stabilize edin.

Reaksiyona girmemiş çapraz bağlayıcıların aktivitesini azaltmak için çapraz bağlama çözeltisini bir su verme reaktifi ile değiştirin. Doğal boyutlarını ve yapılarını korurken bozulmamış protein kompleksine düzgün bir negatif yük veren anyonik bir deterjan olan SDS'yi ekleyin.

İşlem görmüş şeridi yeni bir kasete yerleştirin ve yeni bir SDS-PAGE jeli haline getirin. Elektroforez sırasında, negatif yüklü çapraz bağlı protein kompleksi, pozitif anoda doğru göç eder ve jelde yüksek moleküler ağırlıklı bir bant olarak görünür.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi için hazırlanın. Elektrotları güç kaynağına bağlayın ve jel içindeki proteinleri 150 voltta elektroforez, boya bandı çözme katmanına yaklaşık 2 santimetre ilerleyene kadar. Bu noktada, güç kaynağını durdurun ve bağlantısını kesin.

Elektroforez aparatını söktükten sonra jel kasetinin cam panellerini ayırın. İstifleme katmanını çıkarın ve atın.

Jeli, boya ön kısmının alt kenarının hemen altında, bu kesimin mümkün olduğunca pürüzsüz ve düz olmasına dikkat ederek dikkatlice kesin. Ardından, kullanılmayan jel parçasını atın. Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmayan kısımları kesin.

Şeridi dikkatlice küçük bir kapta 10 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su içine yerleştirin ve dengelemek için 30 dakika boyunca nütasyon ile hafifçe karıştırın. Dengelemeden sonra, PBS'yi atın ve başka bir 10 mililitre ile değiştirin.

Dimetil sülfoksit içinde çözülmüş 500 mikrolitre 25 milimolar DSP'yi PBS'ye pipetleyin ve 30 dakika boyunca daha önce olduğu gibi karıştırmaya devam edin. 30 dakika sonra DSP çözeltisini dökün. Reaksiyona girmemiş DSP'yi söndürmek için% 2 sodyum dodesil sülfat içeren 10 mililitre 0.375 molar Tris-HCl, pH 8.8 ekleyin. Nutasyona 15 dakika devam edin.

Jel şeridi su verirken, SDS-PAGE jel solüsyonlarını standart yöntemlere göre hazırlayın. Polimerizasyon reaktiflerini eklemeyin. Su verme işleminden sonra, mavi doğal jel şeridi oda sıcaklığına geri getirin ve şeridi yeni bir jel kasete atın.

Bunu yapmak için, jeli dikkatlice alın ve temiz bir jel kaset ara plakasına yerleştirin. Şeridi, önceki yönünden ters çevrilecek ve boya ön kısmının alt kısmı yeni kasetin üst kısmına en yakın olacak şekilde yönlendirin.

Şeridi, üst kenarı, kapak plakasının üst kenarının olacağı yerle aynı hizada olacak şekilde yerleştirin. Boya ön yüzünün cam plakanın yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun. Eksize edilen şeridin bir tarafını ara duvarlardan birine doğru itin, diğer tarafta jelin dökülmesi ve bir protein standardı veya merdivenin yüklenmesi için yer bırakın. Jel şeridin alt kenarında pürüzlü veya pürüzlü alanlar varsa, bunları dikkatlice kesin.

Jel şerit doğru şekilde yerleştirildikten sonra, kapak plakasını ara plakanın üzerine yerleştirin. Sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif baskı uygulayın. Jel dökme aparatını üreticinin talimatlarına göre monte etmeye devam edin.

Jel şerit bazen üst plaka yerleştirilirken kayar. Şeridin üst plakanın kenarından biraz sarkmasına yardımcı olur, böylece herhangi bir kaymayı düzeltmek için bir spatula ile ayarlanabilir.

Çözünen jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kasetine dökün. İstifleme tabakasına yer bırakmak için jel kasetini, eksize edilen mavi yerel PAGE jel şeridinin yaklaşık 2 santimetre altına kadar doldurun. Daha sonra, dökülen jelin üzerine 100 mikrolitre bütanol ekleyin ve bütanolü dökmeden önce çözünen tabakanın polimerizasyonu için 30 dakika bekleyin.

Daha sonra, polimerizasyon reaktiflerini istifleme jeli çözeltisine ekleyin. Serolojik bir pipet kullanarak, jel kasetinde kalan tüm boş alanları doldurmak için istifleme katmanını dökün. İstifleme tabakası dökülürken jel kasetini eğin, böylece jel şeridin altındaki boşluğu doldurur ve hava kabarcıkları sıkışmaz.

İstifleme jeli tamponu jel şeridin altındaki boş alanı doldururken, jel kasetini kademeli olarak düz bir zemine getirin. Eksize edilen jel şeridinin yanındaki boş alanı, neredeyse taşana kadar istifleme jeli tamponu ile doldurmaya devam edin. Ardından, istifleme tabakasının 30 dakika polimerize olmasına izin verin.

İstifleme tabakası polimerize olduktan sonra, jel kasetini dökme aparatından çıkarın, damıtılmış su ile durulayın ve elektroforez aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin.

İç hazneyi 1X SDS-PAGE çalışma arabelleği ile tamamen doldurun. Ardından, dış hazneyi üretici tarafından belirtilen seviyeye kadar doldurun. Eksize edilen jel şeridinin yanındaki boşluğu bir moleküler ağırlık merdiveni veya uygun protein standardı ile yükleyin.

Elektrotları güç kaynağına takın ve numuneleri 120 voltta elektroforez edin. Coomassie boyası jelden aktığında, çalışmayı durdurun ve güç kaynağının bağlantısını kesin. Standart elektroblotlama ve antikor bazlı protein tespiti yöntemlerini kullanarak jeli analiz edin.