JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:29 dk • July 8th, 2025
Kılcal elektroforez kullanarak DNA fragmanlarının boyutunu belirlemek için, çok kuyulu bir tahlil plakası alarak başlayın. Her kuyucuk, floresan etiketli, farklı boyutlarda PCR amplikonları içerir - bir PCR döngüsünden sonra elde edilen çift sarmallı DNA oligonükleotidleri.
Kuyuya birkaç farklı boyutta, çift sarmallı DNA parçası ekleyin, bu da bir boyut standardı olarak işlev görür. Bu DNA moleküllerinin her biri, kolay tanımlama için floresan etiketi taşır.
Kuyucuğu güçlü bir denatüran olan formamid ile destekleyin ve yüksek sıcaklıkta ısıtın. Bu adım, DNA'yı denatüre eder ve jel gözeneklerinden kolayca geçebilen tek sarmallı parçalar oluşturur.
Plakayı, kılcal sisteminin içinde önceden enjekte edilmiş polimer jel içeren bir parça analiz ünitesine yerleştirin.
DNA'yı kuyudan katottaki ince çaplı kılcal damara - negatif terminale - elektrokinetik olarak sokmak için yüksek bir voltaj uygulayın. Negatif yüklü DNA molekülleri, pozitif yüklü anoda doğru göç eder. Daha kısa DNA zincirleri daha az sürtünme kuvveti ile karşı karşıya kalır ve jel boyunca daha uzun DNA ipliklerinden daha hızlı hareket eder.
Elektromigrasyon sırasında DNA, lazer ışınının yolunu geçer ve bu da boyanın floresan oluşmasına neden olur. Boyadan gelen emisyon sinyalleri bir dedektör tarafından yakalanır ve daha sonra bir elektroferograma çevrilir - her floresan DNA'yı farklı renkli, ayrı bir tepe noktası olarak temsil eden bir grafik.
Boyutunu analiz etmek için bilinmeyen DNA parçası zirvesini referans zirvelerle karşılaştırın.
PCR amplikonlarının onaylanmasını takiben, PCR ürünlerini 1 ila 10 arasında arıtılmış suda seyreltmek için yeni PCR şeritleri veya plakaları kullanın. Kısaca vorteks ve santrifüj. Bir çeker ocakta çalışırken, formamid ve referans boy standart çözeltiden oluşan bir santrifüj tüpünde bir ana karışım hazırlayın.
Analiz edilecek PCR ürünlerinin sayısına göre, makalede ayrıntılı olarak açıklandığı gibi reaktif hacimlerini kullanın. %10 fazla hacme izin verin.
Kısa bir süre girdap yapın ve 9.5 mikrolitreyi mevcut kılcal elektroforez sistemine uygun bir PCR plakası üzerindeki ayrı kuyucuklara dağıtın. Ardından, 0,5 mikrolitre seyreltilmiş PCR ürünü ekleyin. Kısa bir süre kapatın ve santrifüjleyin.
Ardından, numuneleri içeren plakayı bir PCR termal döngüleyiciye yükleyin ve numuneleri süresiz olarak 95 santigrat dereceye soğutmadan önce 3 dakika boyunca 4 santigrat derecede denatüre edin. 1.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Contayı dikkatlice çıkarın ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir kılcal elektroforez sistemine yükleyin.
Tercih edilen aparata uygun reaktifleri kullanarak parça analizi kapiler elektroforezini çalıştırın ve çalışma koşullarını el yazmasındaki açıklamaya göre ayarlayın.