JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:21 dk • July 8th, 2025
Mikroakışkan elektroforez, mikrokılcal damarlar içindeki farklı büyüklükteki DNA parçalarını ayırmak için kullanılan bir tekniktir.
Başlamak için, jel bazlı polimer ve floresan boya, DNA örnekleri ve bilinen bir moleküler ağırlıklı DNA merdiveni karışımı için belirlenmiş kuyucuklara sahip çok kuyulu bir mikroakışkan çip alın. Bu kuyular bir mikro kanal ağı ile birbirine bağlanır.
Jel-boya karışımını tahsis edilen kuyucuklara dağıtın. Çipi, boş bir şırınga ile önceden donatılmış bir hazırlama istasyonuna monte edin. Jel-boya karışımını ayırma mikrokanalına zorlamak için basınç uygulayarak şırınga pistonunu aşağı doğru bastırın.
Çipi çıkarın ve diğer bileşenleri ilgili kuyucuklarına pipetleyin. Merdiveni ve numuneleri içeren kuyucuklara numune boyutlandırmasını kalibre eden dahili bir standart olan bir işaretleyici ekleyin.
Çipi çalıştırmak için mikroçipi bir parça analizörüne yerleştirin. İçeri girdikten sonra, uygulanan voltaj elektroforetik kuvvetler üretir ve numuneyi kuyudan numune yükleme mikro kanalına sürer ve buradan bu kanal ile ayırma kanalı arasındaki enine kesişme noktasına ulaşır. Elektrik akımı, numunenin ayırma mikro kanalına girmesine yardımcı olur.
Floresan boya molekülleri, moleküler boyutlarına göre farklı elektroforetik hızlarda anoda doğru hareket eden negatif yüklü DNA parçalarını birbirine bağlar - daha küçük parçalar daha büyük olanlardan daha hızlı göç eder. Sonuç olarak, parçalar floresan veren farklı büyüklükte bantlara ayrılır.
Lazer tabanlı bir dedektör, her bandın floresansını ölçer ve bunu, farklı büyüklükteki DNA'yı ayrı bir tepe noktası olarak gösteren bir elektroferogram olarak kaydeder.
Başlamadan önce DNA boya konsantresini, DNA jel matrisini, DNA markörünü, DNA merdivenini ve saflaştırılmış DNA örneklerini oda sıcaklığına getirin. Şırıngayı değiştirerek ve taban plakasını ayarlayarak doldurma istasyonunu kurun. Ardından, şırınga klipsinin kolunu serbest bırakın ve en üst konuma kaydırın.
Boyutlandırma yazılımını başlatın ve jel-boya karışımını hazırlayın. Boya konsantresini 10 saniye boyunca girdaplayın ve aşağı doğru döndürün. Daha sonra, bir jel matris şişesine 25 mikrolitre boya ekleyin ve karıştırmak için çözeltiyi girdaplayın.
Jel-boya karışımını bir döndürme filtresine aktarın. Santrifüje yerleştirin ve 1.500 kez g'de 10 dakika döndürün. Jel boya karışımını yüklemeye hazır olduğunuzda, hazırlama istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin ve "G" ile işaretlenmiş kuyucuğa 9 mikrolitre jel boya karışımı ekleyin.
Doldurma istasyonunu kapatın ve pistonun 1 mililitre işaretine yerleştirildiğinden emin olun. Şırınga pistonunu klips tarafından tutulana kadar aşağı doğru bastırın. Tam olarak 30 saniye bekleyin ve ardından klibi bırakın. 5 saniye daha bekleyin ve ardından pistonu yavaşça 1 mililitre konumuna geri çekin.
Hazırlama istasyonunu açın ve "G" ile işaretlenmiş kuyucuklara 9 mikrolitre jel-boya karışımı ekleyin. Bir merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyuya ve 12 numune kuyucuğunun her birine 5 mikrolitre işaretleyici ekleyin.
Merdiven sembolü olan kuyuya merdivenden 1 mikrolitre, numune kuyucuklarına ise 1 mikrolitre PCR ürünü veya su ekleyin. Çipi 1 dakika ila 2.400 RPM arasında girdaplayın. Biyoanalizöre yerleştirin ve çipi beş dakika içinde çalıştırın.