JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:44 dk • July 8th, 2025
Multimerik proteinler, yapısal ve fonksiyonel bütünlüklerinin korunmasında çok önemli olan sistein kalıntıları arasındaki moleküller arası, kovalent, disülfür bağları ile stabilize edilir.
Bu tür kompleksleri indirgeyici olmayan PAGE ile analiz etmek için, istenen disülfid stabilize protein konsantrasyonunu alın. İndirgeyici olmayan bir numune tamponu ekleyin ve numuneyi ısıtın.
Bu tampon, proteinlere genel bir negatif yük veren SDS ve jel içindeki hareketlerini görselleştirmek için bir izleme boyası içerir. Tampon, disülfid bağlarının bozulmadan kalmasına izin veren ve multimerik kompleksin bozulmadan kalmasını kolaylaştıran herhangi bir indirgeyici maddeden yoksundur.
Tek tek kompleksleri, bir jel aparatına önceden monte edilmiş, istenen yüzdedeki poliakrilamid jelin kuyularına yükleyin. Başka bir kuyucuğa bilinen boyutta bir protein merdiveni ekleyin. Kuyuları SDS tabanlı bir çalışma tamponuna daldırın ve cihazı bir güç kaynağına bağlayın.
Elektrik akımı, negatif yüklü protein komplekslerini jelin gözeneklerinden anoda doğru hareket etmeye zorlar - pozitif terminal. Protein kompleksleri düzgün bir şekilde negatif yüklü olduğundan, ayırma, multimerlerin belirli bir pozisyonda belirgin bir yüksek moleküler ağırlık bandı oluşturduğu boyuta bağlı olarak gerçekleşir.
Ayrılan protein bandının boyutunu merdiven ile karşılaştırın. Jelde daha düşük moleküler ağırlıklı bantların olmaması, sağlam multimerik komplekslerin başarılı bir şekilde ayrıldığını doğrular.
25 milimolar Tris, 192 milimolar glisin ve hacim başına %0.1 ağırlık SDS'yi karıştırarak 1 litre 1X Tris-glisin çalışma tamponu hazırlayın. Ardından, SDS-PAGE çalıştırma cihazını kurun.
Üreticinin protokolüne göre %16 önceden döküm TGX SDS-PAGE paketini açın ve kaseti çıkarın. Kuyucukları kaplayan tarağı ve kasetin altındaki bandı çıkarın ve jeli çalışan aparata yerleştirin. Kuyular sıvıya batırılana kadar hazneyi 1X çalışma tamponu ile doldurun.
Plastik bir pipet kullanarak, kuyuları çalışan tamponla durulayın. Numuneleri, önceden boyanmış standart işaretleyicinin 10 mikrolitresi ile birlikte jelin üzerine yükleyin. Son olarak, boya önü jelin dibinden yaklaşık 1 santimetre uzakta olana kadar jeli 200 voltta çalıştırın.