İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Homojenize tümör dokusundan türetilen protein karışımının iki boyutlu jel elektroforezi için, kaotroplar, zwitteriyonik deterjan ve indirgeyici ajan içeren tampon ile muamele edin. Kaotroplar ve deterjan proteinleri denatüre eder ve çözündürür. İndirgeyici ajanlar, proteinlerin disülfür bağlarını azaltır, serbest tiyol grupları oluşturur ve optimum protein çözünürlüğü için proteinleri açar.

İşlem görmüş protein karışımını hareketsizleştirilmiş bir pH gradyanı, IPG, şerit tutucuya aktarın. Akrilamid jel matrisi içine doğrusal pH gradyanı içeren bir IPG şeridi yerleştirin. Protein çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için mineral yağ ekleyin. Tutucuyu bir izoelektrik odaklama, IEF sistemine aktarın. Protein çözeltisinin şeridi yeniden sulandırmasına izin verin.

Birinci boyut IEF'yi gerçekleştirin. Elektrik akımı, yüklü proteinlerin pH gradyanı boyunca zıt yüklü elektrotlara doğru göç etmesine ve ilgili izoelektrik noktalarında - proteinlerin sıfır net yüke sahip olduğu pH'ta - hareketsiz hale gelmesine neden olur.

IEF sonrası, IPG şeridini, proteinlere negatif yük veren anyonik bir deterjan olan sodyum dodesil sülfat, SDS ile muamele edin. Elektroforez sırasında protein çözünürlüğünü sağlayarak protein tiyol gruplarını modifiye etmek için bir alkilleyici ajan ile dengeleyin.

Şeridi prekast küçük gözenekli poliakrilamid çözücü jel üzerine yükleyin ve erimiş agaroz ile sabitleyin. Odaları SDS içeren elektroforez tamponu ile doldurun. IEF'ye dik olarak ikinci boyut elektroforezini başlatın.

Negatif yüklü, daha büyük moleküler ağırlıklı proteinler, jel boyunca daha küçük proteinlere göre pozitif yüklü anoda doğru yavaşça hareket eder ve boyuta dayalı ayırmayı kolaylaştırır.

Jeli lekeleyin. Proteinler, jel üzerinde ayrı noktalar olarak görselleştirilebilir.

Bu işleme başlamak için, 13 santimetrelik bir IPG şerit tutucunun her bir yuvasına 250 mikrolitre önceden hazırlanmış bir protein örneği çözeltisi ekleyin. Kabarcıkları önlemek için her bir protein numunesi çözeltisinin üzerine jel tarafı aşağı bakacak şekilde 18 santimetrelik bir IPG şeridi yerleştirin. Ardından, her bir IPG şeridini kaplamak için 3 ila 4 mililitre mineral yağ ekleyin.

Ardından, her bir IPG şerit tutucusunu, sivri ucu arka plakada ve kare ucu ön plakada olacak şekilde bir izoelektrik odaklama sistemine monte edin. IPG şeritlerini oda sıcaklığında 18 saat yeniden sulandırdıktan sonra, IEF parametrelerini izoelektrik odaklama sisteminde toplam 7.5 saat ve 36,875 volt saat çalışma süresi ile ayarlayın.

IEF'den sonra, her bir IPG şeridini izoelektrik odaklama sisteminden çıkarın ve fazla mineral yağı çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın. Ardından, her şeridi bir streç filme sarın ve -80 santigrat derecede saklayın.

%12'lik bir PAGE jeli dökmek için bir behere çift damıtılmış su, 1.5 molar Tris-hidroklorik tampon, %40 akrilamid/bisakrilamid stok çözeltisi, %10 amonyum persülfat ve TEMED ekleyin. Kabarcıkları önlemek için jel çözeltisini nazikçe karıştırın.

Jel çözeltisini, beklenen jel yüksekliği olan 19 santimetreye kadar çok döküm bir hazneye yavaşça dökün. Hemen, her bir çözünen jeli kaplamak için çok döküm haznesine yaklaşık 3 mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve her bir jelin yaklaşık bir saat polimerize olmasına izin verin.

Bu adım, yüksek kaliteli bir SDS-PAGE jeli hazırlamak için çok önemlidir. Her jelin üstüne hemen eşit hacimde su eklenmelidir.

İki litre elektroforez tamponu hazırlayın, ardından tamponu bir elektroforez ayırma ünitesi tampon tankına ekleyin.

Odaklanmış IPG şeritlerini dondurucudan çıkardıktan sonra, 1 mililitre indirgeyici denge tamponu ve eser miktarda bromofenol mavisi içeren plastik bir kaba koyun ve hafifçe sallayarak 10 dakika dengeleyin. İndirgeyici denge tamponunu çıkardıktan sonra, IPG şeritlerine 4 mililitre alkilasyon denge tamponu ve bir miktar bromofenol mavisi ekleyin ve hafif sallama ile 10 dakika dengeleyin.

Jel dengesi sırasında, çoklu döküm haznesini sökün ve hazırlanan çözünen jel kasetini çıkarın. Jel kasetini çift damıtılmış suyla üç kez durulayın, ardından jel kasetindeki fazla suyu çözünmeyen bir kağıt havluyla alın ve bir jel standerine yerleştirin.

Bunu takiben, dengelenmiş IPG şeritlerini elektroforez tamponu ile durulayın ve her bir IPG şeridi yüzeyindeki fazla sıvıyı çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın. Çözülen SDS-PAGE jelinin üzerine bir IPG şeridi yerleştirin ve IPG şeridinin plastik tarafının, sivri ucu sola bakacak şekilde daha uzun cam plakaya temas etmesine izin verin.

Şimdi, her bir SDS-PAGE jelinin üstündeki IPG şeridini kapatmak için hızlı bir şekilde 3 ila 4 mililitre sıcak% 1 agaroz ve SDS elektroforez tamponu ekleyin ve IPG şeridinin üst tarafını daha kısa cam plakanın üstüne yerleştirin, kabarcıkları önlemeye dikkat edin.

Bu adımlar, IPG şeridini bir SDS-PAGE jele kapatmak için çok önemlidir. Sıcak agaroz çözeltileri hemen eklenmeli ve IPG şeridi hemen SDS jelinin üstüne yerleştirilmelidir.

Polimerizasyondan sonra, monte edilmiş jel kasetini plastik contalar ile dikey bir elektroforez sistemi arasına dikey olarak yerleştirin. Jelin üst kısmını, katodun yanındaki IPG şeridi ile yerleştirin. Ardından, elektroforez sistemine uygun hacimde tampon ekleyerek jel kasetini daldırmak için elektroforez tamponunun seviyesini ayarlayın.

Güç kaynağını bağlayın ve sabit voltaj modunda ayarlayın ve boyayı izlerken yaklaşık 370 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra jel kasetini elektroforez sisteminden çıkarın ve jelin yırtılmamasına dikkat ederek jeli jel kasetinden nazikçe çıkarın.