Zymography Jel Elektroforezi: Enzimatik aktiviteyi değerlendirerek matris metaloproteinazları tespit etmek için elektroforetik bir teknik

Propeptit ve katalitik alanları içeren çok alanlı bir proteaz olan matris metalloproteinaz veya MMP, belirli hücreler tarafından aktif olmayan bir enzim veya zimojen olarak salgılanır. Katalitik alan çinko iyonu ile propeptid alan sistein kalıntısı arasındaki etkileşim, MMP'yi inaktif tutar.

Enzimografi jel elektroforezi ile hücre kültürü süpernatantındaki MMP'leri tespit etmek için, jel kaseti içeren elektroforez tankını sodyum dodesil sülfat veya SDS içeren çalışma tamponu ile doldurun.

Yükleme tamponu ile karıştırılmış kültür süpernatanıntı, ardından protein standartlarını, MMP'ye özgü bir protein substratı ile kopolimerize edilmiş poliakrilamid jel kuyularına yükleyin.

Negatif yüklü bir deterjan olan SDS, indirgeyici olmayan koşullar altında, MMP'lerdeki sistein-çinko etkileşimlerini bozar ve negatif bir yük verirken proteinleri denatüre eder.

Elektroforez gerçekleştirin. Elektrik alanı, negatif yüklü proteinlerin pozitif yüklü anoda doğru göç etmesine neden olarak proteinlerin boyuta dayalı ayrılmasına neden olur.

Elektroforez sonrası, jeli iyonik olmayan deterjan içeren bir renatüre edici tampon ile işlemden geçirin. İyonik olmayan deterjanlar SDS'nin yerini alır, proteinleri renatüre eder ve MMP aktivitesini kısmen geri kazandırır. MMP'ler ayrıca tamamen aktif bir duruma işlenir.

MMP aktivitesi için gerekli olan iki değerlikli metal katyonları içeren gelişmekte olan bir tamponda inkübe edin. Aktif MMP'ler, katyonlarla birlikte, jeldeki MMP substratını sindirir. Sindirilmiş ürünleri çıkarmak için jeli yıkayın. Jeli lekeleyin.

MMP substratından yoksun MMP aktivitesi alanları, sindirilmemiş substratın koyu mavi bir arka planına karşı şeffaf bantlar olarak görünür. Uygun yazılım kullanılarak, jel bandı yoğunluğu MMP aktivitesi ile ilişkilendirilebilir.

Bu protokolün başlamasından önce, enzimlerin işlevini sürdürmek için tüm matris metalloproteinazları veya MMP'leri yeterince hazırlayın. Numuneler hemen kullanılabilir veya -80 santigrat derecede saklanabilir. Burada, jelatinaz A veya tip IV kollajenaz olarak da bilinen MMP-2, MMP aktivitesinin zimografi ile görselleştirilmesini göstermek için kullanılır.

MMP enzimleri hazırlandıktan sonra, bir kaset içinde bir jel içeren% 10'luk bir jelatin zimogram jel torbası edinin. Kaseti deiyonize su ile durulayın. Kasetin altındaki koruyucu bandı ve tarağı jelin üstünden çıkarın. Tris-Glycine SDS çalışma tamponu ile kuyuları üç kez durulayın.

Jeli, kasetin küçük tarafının içe baktığından emin olarak bir mini hücre elektroforez aparatına yerleştirin. Jel Gerdirme Kaması ile jeli yerine kilitleyin. Cihazın üst haznesini, kuyu seviyesinin üzerinde çalışan Tris-Glycine SDS çalışma tamponu ile doldurun ve herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Jel elektroforez kurulumunun alt odasını da çalışan tamponla doldurun.

Ardından, 10 mikrolitre protein moleküler işaretleyici yükleyin.

Eşit miktarda numuneyi, indirgeyici maddeler içermeyen bir jel yükleme tamponuna karıştırın. Normal SDS-PAGE'den farklı olarak, numuneleri kaynatmayın ve bunun yerine jel yükleme uçlarını kullanarak doğrudan jelin kuyucuklarına yükleyin. Bu kuyular 20 mikrolitreye kadar hacim tutabilir.

Kapağı mini hücrenin üzerine yerleştirin ve elektrot kablolarını güç kaynağına bağlayın. Güç kaynağını açın ve jeli 125 dakika boyunca sabit olarak 90 voltta çalışacak şekilde ayarlayın. Alt haznenin telinde akım sirkülasyonunu gösteren küçük kabarcıkların oluşumunu kontrol edin.

İlk jeli çalıştırırken, yükleme tamponunda bulunan bromofenol mavisini bir gösterge olarak kullanarak her 15 dakikada bir migrasyonun ilerlemesini izleyin. Her jel için, her ikisi de deiyonize suda 100 mililitre 1X zimogram renatüre edici tampon ve 200 mililitre zimogram geliştirme tamponu hazırlayın.

Bromofenol mavisi izleme boyası jelin dibine ulaştığında, güç kaynağını kapatın.

Mini hücreyi açın ve jeli çıkarın. Bir jel bıçak kullanarak kasetin iki tarafını ayırın. Jelin yönünü işaretlemek için bir köşe kesin. Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve 100 mililitre renatüre edici tampon içeren bir kaba koyun.

Jeli oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 30 dakika inkübe edin.

Renatüre edici tamponu çıkarın ve jele 100 mililitre geliştirme tamponu ekleyin. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jele ek olarak 100 mililitre taze gelişen tampon ekleyin. Jeli gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Gece boyunca inkübasyonun ardından, gelişmekte olan tamponu çıkarın ve jeli deiyonize su ile hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ederek yıkayın. Bu yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Jeli plastik bir tabaka koruyucunun üzerine yerleştirin ve kabarcıkları çıkarın. Daha sonra, protein standart bantlarının tam konumunu kaydetmek için jeli bir fotoğraf tarayıcı ile tarayın, çünkü jel boyamadan sonra zar zor görünür hale gelirler.

Jele 20 mililitre SimplyBlue SafeStain ekleyerek jeli lekeleyin. Jeli, hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.

SimplyBlue SafeStain'i çıkarın ve jeli oda sıcaklığında 100 mililitre deiyonize suda hafif çalkalama altında lekeden arındırın.

1 saat sonra taze deiyonize su ile değiştirin ve jeli en az bir saat inkübe etmeye devam edin.