İn Vitro Glikoz Tükenme Testi: Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi Ölçümü Yoluyla Hücresel Glikoz Alımını Ölçmek İçin Floresan Tabanlı Bir Yöntem

Birincil hücresel enerji kaynağı olan glikoz, hücre zarı glikoz taşıyıcı proteinleri yoluyla hücrelere girer. Glikoz, hücre sitoplazmasında glikolitik yol yoluyla piruvata parçalanır ve hücresel metabolizma için adenozin trifosfat veya ATP yoluyla enerji üretir.

Hücre içi glikoz alımını ölçmek için, çok kuyucuklu bir plakada yapışık bir fibroblast kültürü ile başlayın. Ortamı glikoz içermeyen ortamla değiştirin ve inkübe edin. Hücreler, enerji üretmek için mevcut glikozu metabolize eder ve glikoz açlığı durumuna ulaşır.

Bir kuyucuk setindeki ortamı, insülin, bir glikoz alım uyarıcısı ve bir glikoz analoğu olan floresan deoksiglukoz içeren glikoz içermeyen ortamla değiştirin. Başka bir kuyucuk setini floresan deoksiglukoz içeren glikoz içermeyen ortamla tedavi edin.

İnkübasyon sırasında insülin, ek glikoz taşıyıcılarının plazma zarına translokasyonunu uyarır ve glikoz yokluğunda floresan deoksiglukoz alımının artmasını kolaylaştırır.

Deoksiglukoz fosforile edilir ve hücreler tarafından daha fazla metabolize edilmez. Aynı zamanda, floresan deoksiglukozun hücre dışı konsantrasyonu azalır.

İnkübasyon sonrası, kullanılmayan floresan deoksiglukoz içeren ortamı toplayın. Hücreleri bir lizis tamponu ile tedavi edin. Tampon içindeki deterjan miseller oluşturur ve hücre zarlarını çözündürerek hücre içi içerik salınımına neden olur.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, hücre içi floresan deoksiglukoz içeren hücre homojenatının ve kullanılmayan hücre dışı floresan deoksiglukoz içeren ortamın floresansını ölçün.

İnsülin ile uyarılan fibroblastlar, uyarılmamış hücrelere kıyasla hücre içi floresan deoksiglukoz alımında artış ve buna karşılık gelen hücre dışı floresan deoksiglukoz alımında azalma sergiler.

Her simülasyon koşulu için 8 kopya kullanın. Bu nedenle, her simülasyon koşulu için 1 mililitre hazırlayın.

İnsülin olmadan 7 simülasyon koşulu kullanın: Mililitre başına 2.5 mikrogram FD-glikoz, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve 0 oyuklu bir 96 oyuklu plakada mililitre başına miligram.

İnsülin ile 7 stimülasyon koşulu kullanın: mililitre başına 2.5 mikrogram FD-glukoz, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve başka bir 96 oyuklu plakada mililitre başına 0 mikrogram.

Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, mililitre FD-glikoz çalışma çözeltisi başına 1 mikrolitre 5 miligram ve 1 mililitre çalışma stoğu çözeltisi elde etmek için 999 mikrolitre glikoz içermeyen DMEM seyreltin.

Bu çalışma stoğu çözeltisini kullanarak, 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 ve 1:100.000 FD-glikoz dilüsyonları hazırlayın ve mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram elde etmek için ışıksız bir biyogüvenlik kabininde deneylerden hemen önce 2 mililitrelik tüplerde. Bu koşulların her birine 1 mikrolitre insülin ekleyin.

40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikoz içermeyen DMEM'i her bir oyuktan 96 oyuklu plakalarda boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emdirin. Daha önce tarif edilen çeşitli tedavi koşullarından her biri 100 mikrolitreyi bir sütun boyunca kuyucuklara ve aynı tedavi koşulundan 100 mikrolitreyi her iki 96 oyuklu plakadaki sıra boyunca kuyucuklara ekleyin. İnsülinli ve insülinsiz koşulları kullanan plakaları etiketleyin.

Kontrol kuyucuklarına tek başına glikoz içermeyen DMEM ekleyin. Plakayı karanlıkta bir hücre kültürü inkübatöründe 40 dakika inkübe edin.

Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra, aynı deney düzenini koruyarak stimülasyon ortamını her iki plakadan yeni 96 oyuklu plakalara aktarın. Hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve kalan solüsyonu steril kağıt havlular üzerinde boşaltın.

Proteinleri korumak için radyoimmünopresipitasyon test tamponuna bir proteaz inhibitörü ekleyin. Radyoimmünopresipitasyon testi içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nanometre uyarma ve emisyon dalga boylarında, önce hücre dışı FD-glikoz içeren ortamda ve daha sonra 30 dakikalık inkübasyonun sonunda radyoimmünopresipitasyon tahlili ile parçalanmış hücrelere sahip plakada floresan ölçün.