Ligand Testinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi: Bakteriyel Nükleotid İkinci Haberci Bağlayıcı Hücre İçi Proteinleri Tanımlamak İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Bakteriler, uygun uyaranlara yanıt olarak nükleotid ikinci habercileri, NSM'ler - hücre içi sinyal molekülleri - üretir. Bu moleküller hedef proteinlere bağlanır ve bakteri fonksiyonlarını düzenler.

Ligand tahlilinin diferansiyel radyal kılcal etkisini kullanarak bu hedef proteinleri tanımlamak için, çözünür proteinler içeren bakteri hücre lizatı içeren çok oyuklu bir plaka alın. Bu proteinler, genomdaki bireysel ORF'leri (açık okuma çerçeveleri) ifade eden farklı bakteri klonlarından türetilir ve her oyuğun ayrı bir proteine sahip olmasını sağlar.

Guanozin tetra- ve penta-fosfatların bir karışımını ekleyin - radyoaktif fosfor ile etiketlenmiş NSM'ler. Bu moleküller lizattaki hedef proteinlere bağlanır. Bir pim aletiyle, her kuyucuktan eşit miktarda sıvı toplayın. Sıvıyı lekeler halinde biriktirmek için aleti bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin.

Hedef proteinler, kovalent olmayan etkileşimler yoluyla zara bağlanır ve yayılmalarını önler. Bu, bağlı radyo işaretli NSM'leri merkezi uygulama noktasında tutar. Serbest NSM'ler, kılcal hareket yoluyla sıvı faz ile radyal olarak yayılır.

Radyoaktif sinyalleri tespit etmek ve lekelerin dijital bir görüntüsünü elde etmek için fosfor görüntülemeyi kullanın. İki daire kullanarak noktaları tanımlayın. Dış kısım, dağınık NSM'lerin çevresini göstermektedir. İç daire, tecrit edilmiş NSM'leri temsil eder.

Bağlanma fraksiyonunu hesaplayın - dağınık noktanın toplam radyoaktivitesi üzerinden iç daireden tespit edilen radyoaktivitenin yoğunluğu. NSM'ye bağlı hedef proteinlere sahip kuyucukları tanımlamak için yüksek bağlanma fraksiyonlarına sahip noktaları bulun.

Hedef proteinlerin DRaCALA taraması için, 96 oyuklu V-tabanlı bir mikrotitre plakasının ayrı oyuklarına 20 mikrolitre çözülmüş tam hücre lizatları ekleyin ve her oyuğa 2.5 ünite Serratia marcescens endonükleaz ekleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika sonra, lizatları 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Daha sonra, eşit hacimlerde fosfor 32 etiketli guanozin pentafosfat ve guanozin tetrafosfatı karıştırın ve dört nanomolar guanozin pentafosfat çözeltisi elde etmek için karışıma 1x lizis tamponu #1 ekleyin.

Çok kanallı bir pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanarak, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için 10 mikrolitre guanozin pentafosfat karışımını hücre lizatı ile karıştırın.

İnkübasyonun sonunda, 96X pimli bir aleti %0,01'lik bir iyonik olmayan deterjan çözeltisinde 30 saniye boyunca üç kez yıkayın, ardından pim aletini 96 oyuklu numune plakasına yerleştirmeden önce yıkama başına bir kağıt havlu üzerinde 30 saniye kurutun. 30 saniye sonra, pim aletini düz bir şekilde yukarı kaldırın ve 30 saniye boyunca düz bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin.

Beş dakikalık kurumadan sonra, gösterildiği gibi depolama fosfor ekranına maruz kalma ve fosfor görüntüleme ile görselleştirme için nitroselüloz membranı şeffaf plastik klasöre yerleştirin.

Fosfor görüntüleyici ile ilişkili analiz yazılımında potansiyel hedef proteinleri ölçmek ve tanımlamak için, görselleştirilmiş plakaların .gel dosyasını açın.

Analiz edilecek noktaları tanımlamak için, 12 sütuna 8 satırlık bir ızgara oluşturmak için "Dizi analizi" işlevini kullanın. Tüm noktaların dış kenarını sınırlamak için büyük daireler tanımlayın. Küçük iç noktaları sınırlamak için tanımlanan büyük dairelerin "Volumn+Background" ve "Area" öğelerini bir elektronik tabloya aktarın. Tanımlanan daireleri küçültün.

Tanımlanan küçük dairelerin "Volumn+Background" ve "Area" değerlerini dışa aktarın ve tüm verileri elektronik tabloya kaydedin. Daireleri gerektiği gibi noktalarla üst üste gelecek şekilde konumlandırın ve gerçek noktalardan biraz daha büyük olacak şekilde yeniden boyutlandırın.

Elektronik tablodaki bağlayıcı kesirleri hesaplamak için denklemi kullanın ve verileri çizin. Ardından, diğer kuyucukların çoğuna kıyasla yüksek bağlanma fraksiyonları gösteren kuyucuklardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.