Ligand Testinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi: Bakteriyel Nükleotid İkinci Haberci Bağlayıcı Hücre İçi Proteinleri Tanımlamak İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Bakteriler, uygun uyaranlara yanıt olarak nükleotid ikinci habercileri, NSM'ler - hücre içi sinyal molekülleri - üretir. Bu moleküller hedef proteinlere bağlanır ve bakteri fonksiyonlarını düzenler.

Ligand tahlilinin diferansiyel radyal kılcal etkisini kullanarak bu hedef proteinleri tanımlamak için, çözünür proteinler içeren bakteri hücre lizatı içeren çok oyuklu bir plaka alın. Bu proteinler, genomdaki bireysel ORF'leri (açık okuma çerçeveleri) ifade eden farklı bakteri klonlarından türetilir ve her oyuğun ayrı bir proteine sahip olmasını sağlar.

Guanozin tetra- ve penta-fosfatların bir karışımını ekleyin - radyoaktif fosfor ile etiketlenmiş NSM'ler. Bu moleküller lizattaki hedef proteinlere bağlanır. Bir pim aletiyle, her kuyucuktan eşit miktarda sıvı toplayın. Sıvıyı lekeler halinde biriktirmek için aleti bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin.

Hedef proteinler, kovalent olmayan etkileşimler yoluyla zara bağlanır ve yayılmalarını önler. Bu, bağlı radyo işaretli NSM'leri merkezi uygulama noktasında tutar. Serbest NSM'ler, kılcal hareket yoluyla sıvı faz ile radyal olarak yayılır.

Radyoaktif sinyalleri tespit etmek ve lekelerin dijital bir görüntüsünü elde etmek için fosfor