Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu - veya dPCR - tek nükleotid varyantlarının - veya SNV'lerin - genomda belirli bir pozisyonda tek bir nükleotidin ikame edilmesinin iki nükleotid varyasyonu veya alel oluşturduğu bir mutasyonun miktarını belirlemek için yararlıdır.

Tüp içinde çip dPCR tekniğini kullanarak nicelemeye başlamak için, SNV'leri (mutant alel ve karşılık gelen vahşi tip alel) içeren bir DNA örneği alın. Termostabil bir DNA polimeraz enzimi, dNTP'ler ve primerler içeren bir karışım ekleyin.

Daha sonra, aleller arasında ayrım yapmak için farklı renkli floresan raportörleri ile etiketlenmiş alele özgü oligonükleotid probları ve bir söndürücü molekül ekleyin. Söndürücünün muhabire yakınlığı floresansını bastırır.

Çözeltiyi bir mikroakışkan çipin reaksiyon odalarına bölün. Bir alel içeren her oda, bağımsız bir reaksiyon kabı görevi görür.

Çipli tüpü bir termal döngüleyicinin içine yerleştirin ve reaksiyonu başlatın. Yüksek bir sıcaklıkta, çift sarmallı DNA, tek sarmallara denatüre olur. Primerleri ve oligonükleotid problarını tamamlayıcı bölgelerine tavlamak için sıcaklığı düşürün.

Uygun bir uzatma sıcaklığında, DNA polimeraz primerleri uzatır ve probu parçalar. Söndürücüden uzaklık, muhabirin floresan emisyonunu sağlar.

Farklı renkli floresan sinyallerini okuyun ve alelleri içeren odaları tespit etmek için bir konum grafiği oluşturun.

Mutant alelin frekansını belirlemek için - varyant alel fraksiyonu - mutantı içeren odacıkların vahşi tip alele karşı oranını hesaplayın.

Toplam 15 mikrolitre hacim elde etmek için önceden tasarlanmış primerleri, probları ve genomik DNA'yı yeni bir 8 tüplü şeride ekleyin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Yükleme platformunu yeni 8 tüplü şeritte yerleşik olarak bulunan talaşların üzerine ekleyin ve ardından tüp şeridini otomatik yükleyiciye yerleştirin. Talaşlar ve yükleme platformu arasında bir temas olduğundan emin olun. Ardından, yükleme kaydırıcısını platforma yerleştirin ve kaydırıcıyı yükleyiciden uzak tutmak için bir durdurucu kullanın. Kaydırıcının ucuna yakın bir yere 15 mikrolitre PCR karışımı pipetleyin ve ardından yükleyiciyi 1 dakika çalıştırmak için yükleyici düğmesine basın.

Çalıştırmadan sonra boru şeridini yükleyiciden çıkarın ve sızdırmazlık arttırıcıya yerleştirin. Sürgülü kapağı ve üst kapağın kenarını dikkatlice itin. Sızdırmazlık arttırıcıyı yaklaşık 2 dakika çalıştırın. Sızdırmazlık eksikse, bir sıvı birikintisi ile gösterilirse, çalışmayı bir dakika daha tekrarlayın.

Tüplere 230 mikrolitre sızdırmazlık sıvısı ekleyin. Tüp şeridini termal döngüleyiciye yerleştirin ve PCR'yi protokolde açıklandığı gibi çalıştırın. Pozitif bölümlerin eşit olmayan bir dağılımı varsa, PCR'nin sıcaklığını veya süresini ayarlayın.

PCR ürünlerinin floresan yoğunluğunu tespit etmek ve analiz etmek için tüp şeridini algılama aparatına yerleştirin ve 6 mililitre damıtılmış su ekleyin. Bir pipet ucu kullanarak görünür hava kabarcıklarını çıkarın.

Jig'i dedektöre yükleyin. Algılama yazılımında, "Floresan", "Deney" ve ardından "Örnek/NTC" sekmelerini seçin ve çalıştırmayı başlatmak için "Çalıştır" düğmesine tıklayın. Çalıştırmayı tamamladıktan sonra, konum grafiğini, histogramı ve 2B dağılım grafiğini onaylayın.

PCR ürününü toplamak için sızdırmazlık sıvısını tüpten çıkarın. 100 mikrolitre TE tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Tüpleri bir masa üstü santrifüjde kısaca santrifüjleyin ve PCR ürününü toplamayı bitirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi ilerleyin.