Bir doku lizatındaki hedef proteinleri tahmin etmek için kantitatif nokta lekesi

Kantitatif nokta lekesi - veya QDB - bir numunedeki hedef proteinlerin konsantrasyonunu ölçmek için yararlı bir tekniktir. Numune bir polimerik zar üzerinde hareketsiz hale getirildikten sonra, proteinler immünoblotlama yoluyla tespit edilebilir.

Başlamak için, her bir kuyucuğun dibine bağlı bir nitroselüloz membrana sahip çok kuyulu bir plaka olan bir QDB plakası alın. Numuneyi - hedef proteini içeren bir doku lizatı - kuyu içindeki zarın ortasına ekleyin.

Numunenin kurumasını bekleyin. Hedef protein, kovalent olmayan etkileşimler yoluyla zara bağlanır.

Bir engelleme çözümü ekleyin. Çözeltideki proteinler, zar üzerindeki bağlanmamış bölgelere yapışır ve tespit reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını önler.

Daha sonra, numunedeki hedef proteine bağlanan birincil antikorları içeren bir çözelti ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Ardından, ikincil bir antikor çözeltisi ekleyin. Bir peroksidaz enzimi ile etiketlenmiş bu moleküller, proteine bağlı birincil antikorlara bağlanır. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Son olarak, kemilüminesan bir substrat ve hidrojen peroksit içeren bir çözelti ekleyin. Hidrojen peroksit kullanarak, antikora bağlı peroksidaz, substratı oksitler ve ışık yayar. Bir plaka okuyucu kullanarak, numunenin lüminesans yoğunluğunu ölçün.

Hedef proteinin bilinen konsantrasyonları ile seri bir seyreltme kullanarak standart bir lüminesans eğrisi oluşturun. Hedef protein konsantrasyonunu belirlemek için numunenin ölçülen lüminesans değerini eğri üzerinde çizin.

Bu prosedürde, plakanın alt kısmının masa yüzeyine temas etmesini önlemek için QDB plakasının altına boş bir pipet ucu kutusu yerleştirin. 2 mikrolitreye kadar numune yükleyin, QDB plakasının ayrı bir biriminin altındaki membran merkezine.

Yükleme sırasında QDB plakasının alt kısmının herhangi bir yüzeye temas etmesine asla izin vermeyin ve bireysel kuyu için çok fazla yükleme yapmayın. Kuyu başına 4 mikrolitreden fazla yaşamazsınız.

Daha sonra, yüklü QDB plakasını oda sıcaklığında bir saat bekletin veya yüklü plakayı iyi havalandırılan bir alanda on beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Plakayı bloke etmek için QDB plakasını transfer tamponuna batırın ve 10 saniye boyunca hafifçe sallayın.

Bundan sonra, QDB plakasını TBST ile üç kez nazikçe durulayın ve ardından plakayı sürekli çalkalayarak TBST'de beş dakika yıkayın. Daha sonra, QDB plakasını sürekli çalkalama altında bir saat boyunca bloke edici tampon ile bloke edin. Şimdi, bloke edici tampondaki birincil antikoru seçilen bir konsantrasyonda seyreltin ve sıradan bir 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre ekleyin.

QDB plakasını 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve birleşik plakaları oda sıcaklığında iki saat veya sürekli çalkalama altında gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, plakayı TBST ile üç kez yıkamadan önce üç kez TBST ile nazikçe durulayın - her seferinde sürekli çalkalayarak beş dakika boyunca.

Daha sonra, bloke edici tampondaki ikincil antikoru seçilen konsantrasyonda seyreltin ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre alikot edin. Ardından, QDB plakasını yüklü 96 oyuklu plakanın içinde sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. QDB plakasını TBST ile üç kez nazikçe durulayın ve ardından plakayı sürekli çalkalayarak TBST ile her biri beş dakika olmak üzere üç kez yıkayın.

Kantifikasyon için, ECL substratını ve alikotunu kuyucuk başına 100 mikrolitre olan 96 oyuklu bir plakaya hazırlayın. Ardından, QDB plakasını sürekli çalkalama altında iki dakika boyunca 96 oyuklu plakanın içine yerleştirin. Bundan sonra, QDB plakasını 96 oyuklu plakadan çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kısa bir süre sallayın. Ardından, plakayı beyaz bir mikrotitre plakasına yerleştirin. Ardından, mikroplaka okuyucuyu açın ve birleştirilmiş plakaları miktar tayini için mikroplaka okuyucunun içine yerleştirmeden önce kullanıcı arayüzünde kapaklı plakayı seçin.