Protein Ekspresyon Seviyelerini Tahmin Etmek için Kantitatif Western Blotting

Kantitatif western blotlama - toplam protein normalizasyonuna dayalı bir teknik - hedef protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için yararlıdır.

Başlamak için, doku lizatını bir poliakrilamid gradyan jelin kuyucuklarına yükleyin. Lizat, diğer hücresel proteinlerle birlikte hedef proteini içerir.

Jeli, örnek proteinlerin gradyan boyunca elektroforetik olarak ayrılması için uygun bir voltajda çalıştırın. Tamamlandıktan sonra, jeli bir transfer yığınının polimerik zarının üzerine yerleştirin.

Ayrılan proteinleri zar üzerine aktarmak için bir elektrik akımı uygulayın. Ardından, zarı floresan toplam protein boyasına yerleştirin. Boyadaki yüklü boya molekülleri, zar üzerindeki tüm proteinlere elektrostatik olarak bağlanır.

Bir engelleme çözümü ekleyin. Çözeltideki proteinler böylece zara bağlanır. algılama reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek. Sadece hedef proteine bağlanan bir birincil antikor ekleyin. Ardından, birincil antikora bağlanan bir florofor ile etiketlenmiş ikincil bir antikor ekleyin.

Numuneyi bir lazerle uyarın. Toplam protein boyasının boya moleküllerinden ve antikora bağlı floroforlardan yayılan floresansı karşılık gelen dalga boylarında kaydedin.

Normalleştirilmiş protein yükleme değerini hesaplamak için, her şeridin toplam protein sinyalini en yüksek değere bölün. Hedef proteinin nispi ekspresyonunu belirlemek için hedef protein sinyalini karşılık gelen normalleştirilmiş yükleme değerine bölün.

Elektroforez için, jel elektroforez odası sisteminde önceden dökülmüş %4 ila 12'lik bir Bis-Tris gradyan jeli kurun ve kuyuya 3,5 mikrolitre protein standardı yükleyin. Membran normalizasyonu için dahili bir standart kullanırken, protein merdiveninin yanındaki ilk üç oyuğa diğer numunelere eşit bir miktar yükleyin ve kalan oyuklara her numuneden 30 mikrogram yükleyin. Ardından, numuneleri istifleme jelinden 80 voltta 10 dakika boyunca çalıştırın, ardından 150 ila 45 dakika daha 60 voltta çalıştırın.

Elektroforezin sonunda, transfer yığınını monte etmek için, protein jelini poliviniliden diflorür zarını ve ardından filtre kağıdını içeren alt yığına yerleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek için kurutma silindirini kullanın ve hava kabarcıklarını gidermek için yığını tekrar yuvarlamadan önce üst yığını filtre kağıdının üstüne yerleştirin.

Elektrot cihazın sol tarafında olacak şekilde tüm yığını transfer cihazına aktarın ve jel süngeri yığının üzerine yerleştirin, böylece sünger cihazdaki ilgili elektrik kontakları ile hizalanır.

Kapağı kapattıktan sonra uygun programı seçin ve başlatın. Programın sonunda zarı jel boyutuna kadar kesin ve toplam protein lekesine devam etmeden önce kesilen zarı çift distile su ile hızlıca yıkayın.

Toplam protein boyaması için, zarı protein tarafı içe bakacak şekilde 50 mililitrelik bir tüpe yuvarlayın ve zarı bir davlumbazda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir rulo üzerinde 5 mililitre protein boyama solüsyonu ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, membranı 5 mililitre yıkama solüsyonu ile hızlı bir şekilde yıkayın, tüpü yıkamalar arasında kısa bir süre silindire geri döndürün, ardından ultra saf su ile kısa bir durulama yapın. Membrana 3 milimetre bloke edici tampon ekleyin ve membranı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca silindire geri koyun. Bloke edici tamponu, uygun optimize edilmiş konsantrasyonda ilgilenilen birincil antikor ile değiştirin ve zarı silindir üzerinde gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, oda sıcaklığında rulo üzerinde yıkama başına 5 mililitre taze PBS ile membranı 5 dakika boyunca 6 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, zarı rulo üzerinde uygun ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından yıkama başına 30 dakika boyunca 3 yıkama yapın. Son yıkamadan sonra zarı kurutun ve zarı ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın.

Görüntü elde etmek için, zarı protein tarafı aşağı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin ve yazılımda tarama alanını seçin. Ardından her iki kanaldaki görüntüleri alın ve görüntüleri uygun bir görüntü analiz programına aktarın.

Toplam protein boyama sonucunu göstermek için 700 nanometre kanalını görüntüleyin ve "Analiz" i seçin ve normalleştirme için ilgi alanını tanımlamak için bir dikdörtgen çizin. Ardından, tanımlanan bölgenin analiz edilen tüm şeritler için aynı boyutta olduğundan emin olmak için ilk dikdörtgen alanı kopyalayıp her bir örneğe yapıştırın.

Her bir şeritteki protein konsantrasyonunu ölçmek için, hem toplam protein lekesinden hem de ilgilenilen proteinden elde edilen sonuçları bir elektronik tablo programına kopyalayın ve en yüksek toplam protein lekesi sinyalini belirleyin. Ardından, normalleştirilmiş protein yükleme değerini elde etmek için her bir toplam protein boyama sinyal değerini bu değere bölün ve farklı numunelerdeki nispi protein ekspresyon oranını hesaplamak için her bir numuneden 800 nanometre sinyal değerini karşılık gelen normalleştirilmiş protein değerine bölün.