Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

CD95 - bir ölüm reseptörü - agonistik antikorlarına bağlanır ve ölümü indükleyen bir sinyal kompleksinin veya DISC'in - prokaspaz 8'i işe alan bir multiprotein kompleksinin montajını tetikler. DISC'te, prokaspaz 8 bölünür ve çeşitli ara bölünme ürünleri ve son olarak apoptozu başlatan aktif bir form oluşturmak için işlenir.

Kemilüminesan western blotlama kullanarak kaspaz-sekiz işlemeyi analiz etmek için, bir tüpte kaspaz 8'in DISC ile ilişkili ara bölünme ürünlerini içeren bir lizat alın. Bunu protein A-agaroz boncuk yakalanmış anti-CD95 antikorları ile destekleyin. Anti-CD95 antikorları, DISC bileşeni olan CD95'e bağlanarak protein kompleksleri oluşturur.

Farklı boyutta immünopresipite edilmiş kaspaz 8 ara ürünlerini farklı bantlar olarak ayırmak için numuneyi bir SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Jeli bir kurutma zarına yerleştirin ve bir elektrik akımı uygulayın. Kaspaz 8 ara ürünleri jelden lekelenme zarına doğru hareket eder.

Protein bağlanma bölgelerini doyurmak için zarı bloke edici protein içeren bir çözelti ile muamele edin - spesifik olmayan bağlanmaları önleyin.

Belirli bir bölgedeki kaspaz-sekiz ürünlerine bağlanan bir birincil antikor çözeltisi ekleyin.

Bir kasp