Bitki dokusunun toplam RNA ekstraktındaki spesifik mikroRNA'yı tespit etmek ve ölçmek için Northern Blot

MikroRNA'lar, miRNA'lar, küçük, tek sarmallı, kodlamayan RNA'lardır. miRNA, bir multiprotein kompleksine dahil olur ve gen ekspresyonunu negatif olarak düzenlemek için tamamlayıcı hedef mRNA dizilerine daha fazla bağlanır.

Bitki dokularından toplam RNA'dan spesifik miRNA'yı tespit etmek için, izleme boyaları ve bir RNA denatüre edici ajan olan formamid içeren jel yüklemeli bir boya ekleyin. Elektroforezden önce RNA'yı denatüre etmek ve ikincil yapı oluşumunu önlemek için numuneyi ısıtın.

Numuneyi ve standart RNA işaretleyicilerini önceden monte edilmiş bir denatüre edici poliakrilamid jelin kuyularına yükleyin. RNA fragmanlarının boyuta dayalı ayrılmasını kolaylaştıran elektroforez çalıştırın.

Jeli, bir elektroblotlama kaseti üzerindeki önceden ıslatılmış filtre kağıtlarına aktarın. Tamponla ıslatılmış bir naylon kurutma zarını jelin üzerine hizalayın. Ardından, önceden ıslatılmış filtre kağıtlarını istifleyin. Electroblotting yapın.

Elektrik akımı, miRNA da dahil olmak üzere negatif yüklü RNA'nın jelden pozitif yüklü naylon membran yüzeyine hareket etmesine neden olur. Membranı ultraviyole ışığa maruz bırakın; bu, RNA'ları zara çapraz bağlar ve böylece RNA kaybını önler.

Membranı, arka plan gürültüsünü azaltmak için spesifik olmayan bağlanma bölgelerini işgal eden bloke edici maddeler içeren hibridizasyon tamponunda inkübe edin.

Spesifik olarak ona bağlanmak için hedef miRNA'ya tamamlayıcı bir radyoaktif işaretli RNA oligonükleotid probu ekleyin. Membranı tamponla yıkayın, bağlanmamış probları çıkarın.

Radyoaktif hibridizasyon sinyal yoğunluklarını tespit etmek ve ölçmek için bir fosfor görüntüleme sistemi kullanın. Yüksek çözünürlüklü sinyal, bitki dokusundaki spesifik miRNA ekspresyonunu gösterir.

Jelin ön çalışmasını durdurun.

Kuyucukların içindeki üre birikintilerini gidermek için numuneyi yüklemeden önce kuyuları iyice yıkayın. Yeniden askıya alınan RNA örneklerini 98 derecede 1 dakika ısıtın. Kılcal uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyucuklara yükleyin. Hava kabarcıkları sokmaktan kaçının.

Tüm numunelerin tamamen yüklenmesini sağlayın ve kapağı monte edin. Jeli 3 saat boyunca veya bromofenol mavisi tamamen akana kadar 80 voltta çalıştırın. Aktarım için pozitif yüklü naylon membran kullanın. Cam plakanın boyutlarına göre kesin. Membranı sağ üst köşesinde etiketleyin. Membranı steril Milli-Q suyun yüzeyine nazikçe yerleştirin. Etiketi su yüzeyine bakacak şekilde aşağı bakacak şekilde yerleştirdiğinizden emin olun.

Temiz bir tepsi alın ve elektrotransfer için jel sandviç hazırlayın. Kasetin gri tarafını aşağı yerleştirin. Kaset seviyesinin biraz üzerine 1X TBE dökün. Fiber pedi 1X TBE'de önceden ıslatın ve hava kabarcıklarını gidermek için sıkın. İki parça kurutma kağıdını fiber ped boyutunda kesin.

Bir parça kurutma kağıdını 1X TBE'de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıdın üzerine plastik bir pipet sararak hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir kurutma kağıdını 1X TBE'de önceden ıslatın ve kasetin üzerine koyun. Hava kabarcıklarını gidermek için yuvarlanın. Artık sandviç kurulumu elektrotransfer için hazırdır.

Elektroforez tamamlandıktan sonra, çalışmayı durdurun ve kapağı cihazdan çıkarın. Çalışan kaseti kurulumdan çıkarın. Çalışan kasetten cam plakaları çıkarın.

Jeli tertibattan dikkatlice çıkarın. İlk yüklenen RNA örneği sağınıza doğru olacak şekilde kurutma kağıdının üzerine koyun. Önceden ıslatılmış membranı nazikçe 1X TBE'ye batırın ve etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Membran ve jelin kurumasına izin vermeyin. Hava kabarcıklarını gidermek için yavaşça yuvarlayın.

Bir parça kurutma kağıdını 1X TBE'ye batırın ve zarın üzerine koyun. Hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir kurutma kağıdı parçası yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın. Fiber pedi düzeneğin üzerine sererek sandviçi tamamlayın. Kaseti sıkıca kapatın.

Transblot kasetini modüle yerleştirin. Depoyu lekeleme işaretine kadar 1X TBE, pH 8.2 ile doldurun. Cihazın kapağını kapatın ve gece boyunca 10 derecede veya soğuk bir odada 4 voltta aktarın. UV çapraz bağlayıcıyı hazır tutun ve elektro transferin tamamlanmasından hemen önce 1.200'e ayarlayın.

Aktarım tamamlandıktan sonra kaseti modülden çıkarın. Nemli membranı, işaretli tarafı yukarı bakacak şekilde bir A4 kağıda yerleştirin. 120 milijoule'de 254 nanometre UV ışığı ile ışınlayarak RNA'yı zara çapraz bağlayın. Çapraz bağlı leke 4 derecede saklanabilir veya hibridizasyon için kullanılabilir.

Tespit edilmesi gereken küçük RNA'yı tamamen tamamlayıcı bir prob tasarlayın ve PNK enzimini kullanarak probu 5 ana ucunda etiketleyin ve bileşenleri gösterildiği gibi birleştirin. Reaksiyon karışımını 37 derecede 30 dakika inkübe edin.

30 dakikalık inkübasyondan sonra, etiketlenmemiş probları reaksiyon karışımından ayırmak için G-25 kolonlarını kullanın. Probun daha iyi etiketlenmesi için, kullanmadan önce G-25 sütununu hazırlayın. Lekeyi, RNA tarafı üste bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesinin içine yerleştirin. Kullanmadan önce hibridizasyon tamponunu kuvvetlice karıştırın. 10 ml hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon şişesini dönüşlü olarak 35 derecede tutulan bir hibridizasyon fırınına yerleştirin.

20 ila 30 dakika boyunca ön hibridizasyon gerçekleştirin. Ön hibridizasyondan sonra şişeyi fırından çıkarın. Etiketli probu nazikçe hibridizasyon tamponuna ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşmadığından emin olun. Lekeyi fırının içinde 12 saat döndürerek 35 derecede inkübe edin.

Hibridizasyondan sonra, hibridizasyon tamponunu şişeden çıkarın. Yıkama tamponu I'i kullanarak lekeleri hızlı bir şekilde yıkayın. Bu adım, fazla hibridizasyon çözeltisini lekelerden çıkarmak için gerçekleştirilir. Ayrıca, yıkama tamponu I kullanarak lekeleri 35 derecede 30 dakika inkübe edin ve 35 derecede 30 dakika boyunca tampon II kullanarak başka bir yıkama yapın.

Lekeyi yıkadıktan sonra, bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve kapatın. Bir kasetin içine yerleştirin ve 12 saat boyunca radyasyon içermeyen bir fosfor görüntüleyici ekranına maruz bırakın. Typhoon Biomolecular Imager kullanarak hibridizasyon sinyalini tespit edin ve ImageJ yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin.