Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptit probu

Hücrelerde proteinler, yapılarındaki belirli diziler aracılığıyla etkileşen proteinlerine bağlanır - hücre içi protein işleyişini modüle eder.

Hücre içi protein etkileşimlerini tespit etmek için, yapışık bir hücre kültürü alın. Ortamı aspire edin.

Biyotinile hücreye nüfuz eden bir peptit, BCPP çözeltisi ekleyin ve inkübe edin.

Her BCPP, hedeflenen hücre içi proteine spesifik bağlanmaya yardımcı olan bir peptit dizisi içerir. Peptit, peptitin N-terminalinde hücreye nüfuz eden bir peptit olan CPP'ye ve kolay tespit için C-terminalinde biyotine sahiptir.

İnkübasyon sırasında, pozitif yüklü CPP bölgesi, hücre zarından bağlı peptit girişini kolaylaştırarak sitoplazmaya ulaşır. Peptit, hücre içi etkileşimli protein ortağına bağlanır ve bir BCPP hedef protein kompleksi oluşturur.

Hücrenin zarını parçalayan ve BCPP hedef protein komplekslerini ve diğer hücresel bileşenleri serbest bırakan deterjan molekülleri içeren bir tampon ekleyin.

BCPP'lerdeki biyotine spesifik olarak bağlanan bir glikoprotein olan agaroz boncuk bağlı avidin çözeltisi ekleyin. İnkübe edin, avidinin biyotine geri dönüşümsüz bağlanmasına izin verin ve avidin-BCPP hedef protein komplekslerini saflaştırın.

Boncukları peletlemek için santrifüjleyin. Proteinler arasındaki kovalent olmayan bağları parçalamak ve biyotin-avidin boncuklarından CPP-peptid-protein komplekslerini elüte etmek için boncukları bir tamponda yeniden süspanse edin.

CPP-peptid-protein komplekslerini western blotlama ile analiz edin. CPP-peptid-protein kompleksi için kompleksin bileşenlerinden daha yüksek bir moleküler ağırlık bandı, etkileşen protein ortakları arasında başarılı bir etkileşimi gösterir.

Etkili olduğu kanıtlanmış konsantrasyona ulaşmak için BCPP'nin stok çözeltisinin hacmini hücre kültürlerine ekleyin.

Bu nedenle, mililitre kültür ortamı başına mililitre başına 92.8 mikrolitre 2 miligram TAT-Connexin-43_{266-283-Biotin} ekleyin. BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimlerin gerçekleştiğinden emin olmak için hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre yerleştirin.

Protein ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için önce kültür ortamını tamamen aspire edin. Ardından, hücre ayrılmasını önlemek için hücreleri 150 santimetrede 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile çok dikkatli bir şekilde yıkayın.

Hücre lizatını elde etmek için, 150 santimetrekare şişeye 3 mililitre lizis tamponu ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzeyi iyice kazıyın. Şişeyi yaklaşık 45 dereceye kadar eğmek, hücre lizatlarının karşılık gelen tüplerine toplanmasını kolaylaştıracaktır.

Tüp başına 1 mililitre hücresel lizat, koşul başına işaretlenmiş 3 adet 1.5 mililitrelik tüpe dökün. Aşağı çekme için, 1.5 mililitrelik tüpleri 11.000 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanları A etiketli yeni tüplere aktarın. Koşul başına süpernatantın bir alikotunu B etiketli farklı tüplere aktarın. Daha sonra 50 mikrolitre lizat için 16,6 mikrolitre 4x Laemmli tamponu ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, NeutrAvidin agarozunu hafifçe çalkalayarak çok iyi homojenize edin.

Çaplarını artırmak ve boncukların pipetlenmesini iyileştirmek için pipet uçlarının uçlarını kesin. Daha sonra, A tüplerinde mililitre hücre lizatı başına 50 mikrolitre NeutrAvidin agaroz ekleyin. NeutrAvidin'in hücre içi ortaklarına bağlı BCPP'lerle etkileşime girmesine izin vermek için hücre lizatlarını gece boyunca 4 santigrat derecede çok hafif çalkalama ile inkübe edin.

Daha sonra, proteinlerle NeutrAvidin kompleksini toplamak için% 4 santigrat derecede 1 dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve C etiketli temiz tüplere aktarın.

NeutrAvidin kompleksini proteinlerle yıkamak için, A tüplerinin topaklarına taze lizis tamponu ekleyin. Peleti ters çevirerek yeniden süspanse edin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bu yıkamayı beş kez daha tekrarlayın. Bütün bu süpernatantlar atılabilir.

Daha sonra, 150 santimetre karelik birleşik hücre şişelerinden elde edilen peletler için 1.5 mililitrelik tüp başına 40 mikrolitre 2x Laemmli tamponu ekleyin. Ardından, proteinler arasındaki etkileşimleri ayırmak için 5 dakika boyunca 100 santigrat derecede elüte edin.

Elüsyonu takiben, NeutrAvidin boncuklarını peletlemek için 8.200 kez g'de 30 saniye santrifüjleyin. Kılcal uçlarla ayrışmış proteinleri içeren süpernatanları D etiketli yeni tüplere aktarın.

Bu süpernatantlar artık metin protokolünde açıklandığı gibi bir Western lekesine yüklenmeye hazırdır veya eksi 20 santigrat derecede dondurulabilir.