Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Floresan dalgalanma spektroskopisi, bir numunedeki proteinlerin oligomerizasyon durumunu belirleyebilir.

Başlamak için, floresan etiketli bir protein monomer çözeltisi içeren odacıklı bir slayt alın. Slaytı konfokal bir mikroskop altına yerleştirin. Protein monomerlerini uyarmak için lazer ışınını numunenin küçük bir kısmına (konfokal hacim) odaklayın.

Protein molekülleri, Brown hareketi nedeniyle konfokal hacmin içine ve dışına yayılır. Bu hareket, floresan yoğunluğunda hızlı değişikliklere neden olarak zamanla floresan yoğunluğunda dalgalanmalara yol açar.

İki protein monomerinin bağlanmasına ve böylece bir dimer oluşturmasına yardımcı olan iki değerlikli bir ligand olan dimerize edici ajanı ekleyin. Dimerizasyon nedeniyle, iki floresan etiket tek bir parçacık oluşturmak için bir araya gelir, bu da parçacık başına floresan yoğunluğunu artırır - moleküler parlaklık.

Dimerizasyona bağlı moleküler parlaklıktaki artış, floresan dalgalanmalarının genliğini arttırır - iki floresan etiket konfokal hacme birlikte girip çıktıkça.

Dimerize edici ajanı eklemeden önce ve sonra zaman boyunca konfokal hacmin görüntülerini elde edin.

Konfokal görüntülerdeki tek tek piksellerin parlaklığını hesaplayın ve zaman içindeki ortalama parlaklık eğrisini elde edin.

Dimerize edici ajanın eklenmesi, her bir parçacıktan gelen ikili floresan sinyalleri nedeniyle parlaklıkta iki kat artışa neden olurken, toplam protein molekülü sayısı aynı kalır - bu da dimer oluşumunu gösterir.

Çok kuyulu plaka dizisini kurmak için önce boyut dışlama kromatografisi için kullanılan aynı tamponda 100 nanomolar saflaştırılmış FKBP12'den oluşan bir çözelti hazırlayın. Agrega oluşumunu önlemek için 13.000 RPM'lik hızlı bir dönüş ile sonikat ve santrifüjleyin.

Şimdi, seyreltilmiş proteinin 100 ila 200 mikrolitresini cam tabanlı 8 oyuklu bir gözlem odasına pipetleyin. BB dimerizeratörü 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nanomolar nihai konsantrasyonlara ekleyin. Referans olarak, potansiyel toplama ve çökelme etkilerini değerlendirmek ve aynı toplama ayarlarıyla monomer için bir parlaklık değeri elde etmek için tek başına 100 nanomolar mVenüs'ten oluşan bir çözelti hazırlayın.

Dijital dedektörler veya iyi karakterize edilmiş analog dedektörlerle donatılmış ve elde edilen her piksel için sabit bir bekleme süresi tutabilen herhangi bir ışık taramalı mikroskop konfokal sistemi kullanılabilir. Floresan korelasyon spektroskopisi için tasarlanmış yaka düzeltme suya daldırma objektifini seçin.

Şimdi yaka düzeltme suya daldırma hedefine bir damla su ekleyin. 8 kuyulu gözlem odasını sahneye monte edin. 514 nanometre lazeri açarak ve objektifin çıkışında 20 ila 100 nanowatt güce ayarlayarak uyarma ışını yolunu ayarlayın. Bir HyD dedektörünü açın. Foton sayma yapabilen dedektörler tercih edilir. 520 ila 560 nanometre arasında emisyon penceresini seçin.

Çekim modu için 16 x 16 piksel kullanın.

Piksel bekleme süresini, kare süresi protein difüzyonundan daha uzun ve piksel bekleme süresi çok daha kısa olacak şekilde ayarlayın. Bu, bu gösteride kullanılan sistem için bekleme süresinin yaklaşık 13 mikrosaniyeye ayarlanmasına karşılık geldi.

İğne deliğini, yaklaşık 545 nanometrelik karşılık gelen emisyon için bir Airy ünitesine ayarlayın. xy zamanlı alım modunu seçin ve alım ve kuyu başına alınacak kare sayısını seçin. Şimdi, piksel boyutunu yaklaşık 120 nanometre olarak ayarlayın.

Sistem yüksek verim modu ile donatılmışsa, süreci otomatikleştirmek için her bir kuyunun koordinatlarını ve kuyu başına satın alma sayısını tanıtın. Sistem bir perfüzyon sistemi ile donatılmışsa, BB solüsyonunu yükleyin ve 10.000 görüntü elde ederken dimerizasyon kinetiğini değerlendirmek için perfüzyonu 5.000. kareden hemen sonra başlayacak şekilde programlayın.

Doğru kuyuyu seçin ve çözüme odaklanın. Ardından, alımı başlatın ve elde edilen görüntü yığınını TIFF biçiminde kaydedin.