Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Afinitesini Belirlemek için Floresan Anizotropisi

Transkripsiyon faktörü, TF, bir genin spesifik DNA bölgesine bağlanan ve transkripsiyonu düzenleyen bir proteindir.

Floresan anizotropisi ile TF-DNA etkileşimlerini ölçmek için çok kuyulu bir plaka alın. Bir TF bağlama bölgesi ve daha yüksek bir TF molekülü konsantrasyonu içeren bilinen konsantrasyonlarda florofor etiketli referans DNA içeren tamponlu bir çözelti ile karıştırılmış erimiş jeli kuyuya ekleyin ve inkübe edin.

Etiketli referans DNA jel içinde dağılırken, daha yüksek bir TF molekül konsantrasyonu, tüm DNA moleküllerinin TF'ye bağlı olmasını sağlar. Tek noktalı mutasyona sahip etiketlenmemiş rakip DNA içeren tamponlu bir çözelti ekleyin.

Yüksek performanslı floresan anizotropi mikroskobu kullanarak plakanın jelini analiz edin.

Polarize ışık, moleküler yuvarlanma nedeniyle yeniden yönlendirilen ve çok yönlü depolarize ışık yayan referans DNA'ya bağlı floroforu uyarır - floresan anizotropisi, FA adı verilen bir fenomen.

TF'ye bağlandıktan sonra, referans DNA'ya bağlı floroforun moleküler ağırlığı artar ve daha yavaş yuvarlanır, FA'yı artıran daha polarize ışık yayar.

Etiketlenmemiş rakip DNA, zamanla jel matrisi boyunca yayılır ve yüksekten düşüğe konsantrasyon gradyanı ol