Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Afinitesini Belirlemek için Floresan Anizotropisi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 5:00 dk • July 8th, 2025

Transkripsiyon faktörü, TF, bir genin spesifik DNA bölgesine bağlanan ve transkripsiyonu düzenleyen bir proteindir.

Floresan anizotropisi ile TF-DNA etkileşimlerini ölçmek için çok kuyulu bir plaka alın. Bir TF bağlama bölgesi ve daha yüksek bir TF molekülü konsantrasyonu içeren bilinen konsantrasyonlarda florofor etiketli referans DNA içeren tamponlu bir çözelti ile karıştırılmış erimiş jeli kuyuya ekleyin ve inkübe edin.

Etiketli referans DNA jel içinde dağılırken, daha yüksek bir TF molekül konsantrasyonu, tüm DNA moleküllerinin TF'ye bağlı olmasını sağlar. Tek noktalı mutasyona sahip etiketlenmemiş rakip DNA içeren tamponlu bir çözelti ekleyin.

Yüksek performanslı floresan anizotropi mikroskobu kullanarak plakanın jelini analiz edin.

Polarize ışık, moleküler yuvarlanma nedeniyle yeniden yönlendirilen ve çok yönlü depolarize ışık yayan referans DNA'ya bağlı floroforu uyarır - floresan anizotropisi, FA adı verilen bir fenomen.

TF'ye bağlandıktan sonra, referans DNA'ya bağlı floroforun moleküler ağırlığı artar ve daha yavaş yuvarlanır, FA'yı artıran daha polarize ışık yayar.

Etiketlenmemiş rakip DNA, zamanla jel matrisi boyunca yayılır ve yüksekten düşüğe konsantrasyon gradyanı oluşturur. Daha yüksek bir etiketlenmemiş rakip DNA konsantrasyonu, etiketli referans DNA'nın yerini alır ve kendisini TF'ye bağlar. Serbest bırakılan etiketli referans oligomerler daha hızlı yuvarlanır ve FA'yı azaltır.

Floroforun FA'sını ve rakip DNA'nın zaman içindeki konsantrasyon gradyanını çizin - bu, daha fazla rakip DNA molekülü referans DNA'nın yerini aldıkça azalır.

96 oyuklu bir plakanın titrasyon ve kalibrasyon kuyularını hazırlamak için, iki jel stoğu alikotunu 75 derecelik bir inkübatör çalkalayıcıya aktarın.

Her titrasyon kuyusu için, 1.4 nanomol referans DNA, 20 ila 60 nanomol nihai konsantrasyonda transkripsiyon faktörü proteini, 0.2 milimolar DTT ve erimiş jelin 240 mikrolitresine bağlayıcı tampon ekleyin.

Tüpü ters çevirerek ve sallayarak iyice karıştırın. Ardından, 96 oyuklu bir plakanın belirlenmiş titrasyon kuyucuklarında DNA içeren jelin oyuklu başına 200 mikrolitresini yavaşça pipetleyin. Her kalibrasyon kuyusu için, erimiş jelin 240 mikrolitresine 5 nanomol Nil mavisi boya ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak, 200 mikrolitre boya içeren jel solüsyonunu 96 oyuklu plakanın beş ila altı oyuğuna yavaşça pipetleyin.

Jeli mükemmel yatay bir yüzeye yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika ve 4 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Plakanın farklı oyuklarındaki jel yükseklik seviyelerinin homojenliğini kontrol etmek için çok kuyulu bir plaka okuyucu kullanın.

Rakip DNA çözeltisini hazırlamak için önce etiketli referans DNA'yı, proteini ve üç katlı konsantre bağlayıcı tamponu birleştirin. Daha sonra, çözeltinin 20 mikrolitresini, tavlanmış rakip DNA çözeltilerinin her birinden 40 mikrolitre ile karıştırın.

Her kalibrasyon kuyusu için, tavlanmış rakip DNA çözeltilerinden birinin uygun miktarlarını ve 15 milimolar Nil mavisi boya çözeltisi içeren üç katlı konsantre bağlayıcı tamponu birleştirin. Son olarak, jellerin üzerine mümkün olduğunca aynı anda 50 mikrolitre karışık rakip solüsyon ekleyin.

Görüntü almaya başlamak için, 96 oyuklu plakayı mikroskop tablasına yerleştirin. Daha sonra, proteinin referans DNA'dan tamamen ayrılmasına kadar kuyuların z-yığını görüntülerinin zaman serilerini alın.

Titrasyon testini el yazmasına göre gerçekleştirin. Ardından, ayrı rakip dizileri için titrasyon eğrileri oluşturmak üzere HiP-FA yazılımını kullanın. Ardından, her titrasyon kuyucuğundaki aktif proteinin ayrışma sabitini ve konsantrasyonunu elde etmek için "Dışa Aktar" düğmesine tıklayın.

11:25

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:45

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:02

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:41

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:31

Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:43

Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:44

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:08

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:38

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:34

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026