RNA-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için SELEX Tabanlı İn Vitro Bağlanma Testi

Ligandların üstel zenginleştirme ile sistematik evrimi, SELEX, protein bağlayıcı RNA dizilerinin tanımlanmasına izin verir.

İlk olarak, yüksek derecede spesifik yapılara katlanan randomize dizilere sahip radyoaktif işaretli RNA'ları içeren randomize bir RNA havuzu elde edin. Hedef protein ile inkübe edin. Protein, spesifik diziler ve üç boyutlu yapılarla RNA moleküllerine bağlanırken, spesifik olmayan RNA'lar bağlanmadan kalır.

Karışımı bir nitroselüloz filtreden geçirin. Bağlanmamış RNA, filtre gözeneklerinden geçerken, RNA-protein kompleksleri tutulmaya devam eder.

RNA-protein kompleksi içeren filtreyi parçalara ayırın. RNA havuzunu azaltılmış hedef protein konsantrasyonu ile inkübe ederek RNA-protein etkileşimini tekrarlayın - düşük afiniteli diziler bağlanamazken yalnızca yüksek afiniteli dizi bağlanmasına izin verir.

Bu karışımı bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve elektroforez yapın. RNA-protein kompleksleri, düşük afiniteli ve bağlanmamış RNA'lara kıyasla jel boyunca yavaşça göç eder. X-ışını jel görüntüleme, RNA-protein kompleksi konumuna karşılık gelen bir bant kayması gösterir.

Kompleks içeren jel kısmını dilimleyin. Proteinaz K'yi filtre parçalarına ve jel dilimlerine ekleyin, proteinleri sindirin ve RNA'yı kompleksten serbest bırakın. RNA'yı sindirilmiş proteinlerden ayıran fenol-kloroform ve santrifüj ekleyin.

RNA içeren süpernatanı sodyum asetat ve etanol ile karıştırın. RNA'yı çökeltmek için santrifüjleyin. RNaz içermeyen suda tekrar süspansiyon haline getirin. RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya ters transkribe edin ve DNA'yı PCR ile çoğaltın.

Hedef proteine özgü DNA dizilerinden oluşan bir havuz elde etmek için birkaç tur filtre bazlı ve jel bazlı ayırma işlemini tekrarlayın.

Protein ve RNA'yı 100 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde bağlamak için, önce pH 7.5'te 10 milimolar tris-hidroklorür hazırlayın, 50 milimolar potasyum klorür, bir milimolar DTT, mikrolitre başına 0.09 mikrogram sığır serum albümini, mikrolitre RNAsin başına 0.5 birim, mikrolitre tRNA başına 0.15 mikrogram ve 1 milimolar EDTA. Daha sonra uygun havuzdan 30 mikrolitre rekombinant protein PTB ve 10 mikrolitre RNA ekleyin.

Bağlanma reaksiyonlarını içeren tüpleri 25 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika boyunca bir sıcaklık bloğuna yerleştirin. Daha sonra, bağlı RNA'yı bağlanmamış RNA'dan dört tur seçim ve amplifikasyon yoluyla parçalara ayırın. İlk olarak, 100 mikrolitrelik numuneyi oda sıcaklığında bir vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden süzün. RNA-protein kompleksi filtrede kalır.

Steril bir tıraş bıçağıyla filtreyi parçalara ayırın ve bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre parçalarını proteinaz K tamponuna daldırın ve RNA'yı geri kazanmak için en az üç saat veya gece boyunca bir bardağa yerleştirin.

RNA örneğini deproteinize etmek için eşit hacimde fenol-kloroform, girdap ekleyin. Ve sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin. Sulu fazı elde edin ve tekrar kloroform ile ekstrakte edin. Bundan sonra, süpernatanı pH 5.2'de 1/10 hacim 3 molar sodyum asetat ve iki ila üç hacim mutlak etanol ile karıştırın.

Tüpü -80 santigrat derece dondurucuda 30 dakika bekletin ve ardından 10 dakika yüksek hızda santrifüjleyin. Yıkama ve kurutma adımlarını %70 etanol ile tekrarlayın ve RNA'yı DEPC ile muamele edilmiş suda çözündürün. Filtre bağlama testinin ilk turundan sonra, üç tur daha gerçekleştirin.

Ardından, proteine bağlı RNA fraksiyonlarını bağlanmamış fraksiyonlardan ayırmak için iki tur transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon gerçekleştirin. 0,5x TBE tamponunda 60 ila 1 akrilamid bisakrilamid oranına sahip doğal bir %5 poliakrilamid jeli önceden döküldü. Ardından, RNA-protein bağlanma reaksiyonunu ayarlayın.

Jeli, 4 santigrat derecede soğuk bir odada 0,5x TBE tamponu ile doldurulmuş bir elektroforez cihazına yerleştirin. 15 dakika boyunca 250 volt uygulayın ve bağlanma reaksiyonunu farklı kuyucuklara pipetleyin. Daha sonra, ayrıca, elektroforezi bir ila iki saat boyunca 250 voltta çalıştırarak bağlı RNA'yı bağlanmamış RNA'dan ayırın.

Daha sonra, jeli bir X-ışını filmine maruz bırakın ve otoradyografi kullanarak bağlı RNA'nın yerini belirleyin. Bağlı RNA ile jel dilimini kesin ve bir tüpe yerleştirin. Jel dilimini ezin ve proteinaz K tamponunda üç saat veya gece boyunca inkübe edin. Ekstraksiyonu daha önce tarif edildiği gibi fenol-kloroform ve kloroform ile tekrarlayın. Çözünmüş RNA'dan cDNA'yı sentezleyin.

İki mikrolitre 10x RT tamponu, iki mikrolitre AMV ters transkriptaz, 1 mikrolitre ters astar, 5 mikrolitre su ve 10 mikrolitre çözünmüş RNA dahil olmak üzere 20 mikrolitre reaksiyon hazırlayın. 42 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Daha önce tarif edildiği gibi 20 ila 25 PCR döngüsü kullanarak cDNA'yı amplifiye edin. RNA sentezi, protein bağlanması ve proteine bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların ayrılması işlemini tekrarlayın.