RNA-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için SELEX Tabanlı İn Vitro Bağlanma Testi

Ligandların üstel zenginleştirme ile sistematik evrimi, SELEX, protein bağlayıcı RNA dizilerinin tanımlanmasına izin verir.

İlk olarak, yüksek derecede spesifik yapılara katlanan randomize dizilere sahip radyoaktif işaretli RNA'ları içeren randomize bir RNA havuzu elde edin. Hedef protein ile inkübe edin. Protein, spesifik diziler ve üç boyutlu yapılarla RNA moleküllerine bağlanırken, spesifik olmayan RNA'lar bağlanmadan kalır.

Karışımı bir nitroselüloz filtreden geçirin. Bağlanmamış RNA, filtre gözeneklerinden geçerken, RNA-protein kompleksleri tutulmaya devam eder.

RNA-protein kompleksi içeren filtreyi parçalara ayırın. RNA havuzunu azaltılmış hedef protein konsantrasyonu ile inkübe ederek RNA-protein etkileşimini tekrarlayın - düşük afiniteli diziler bağlanamazken yalnızca yüksek afiniteli dizi bağlanmasına izin verir.

Bu karışımı bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve elektroforez yapın. RNA-protein kompleksleri, düşük afiniteli ve bağlanmamış RNA'lara kıyasla jel boyunca yavaşça göç eder. X-ışını jel görüntüleme, RNA-protein kompleksi konumuna karşılık gelen bir bant kayması gösterir.

Kompleks içeren jel kısmını dilimleyin. Proteinaz K'yi filtre parçalarına ve jel dilimleri