Canlı hücrelerde reseptör-ligand etkileşimlerini görselleştirmek için kafes ışık tabakası mikroskobu

Kafes ışık tabakası mikroskobu, LLSM, yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip canlı hücrelerde hücre yüzeyi reseptörü-ligand etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlar.

Kırmızı floresan yayan transdüksiyonlu ligand eksprese eden hücreler içeren bir lamel alın. Lamel hücresi yukarı bakacak şekilde yağlanmış bir numune tutucuya takın. Görüntüleme sırasında hassas numune konumlandırma ve taramaya izin vermek için tutucuyu bir mikroskop aşamasının piezosuna sabitleyin. Yazılım ayarlarını, tek bir ligand ifade eden hücreye odaklanacak şekilde ayarlayın.

Reseptör eksprese eden hücre süspansiyonunu lamel üzerine pipetleyin. Reseptörler yeşil florofor işaretli antikorlarla etiketlenir. Etkileşen hücre çiftlerini görüntüleyin.

Mikroskobun uyarma lazeri, bir ışık tabakası oluşturmak için silindirik lenslerden geçen dairesel, doğrusal polarize bir lazer ışını yayar. Işık tabakası, fazla kırınımı ortadan kaldıran ve onu ultra ince bir kafes desenine dönüştüren bir modülatör üzerine yansıtılır.

Kafes ışık tabakası, etkileşen hücre çiftinin ultra ince bir bölümünü aydınlatır ve etkileşen hücreler tarafından yayılan floresan, gelen ışına dik olarak yakalanır. Etkileşen hücre çiftini birden fazla Z düzleminde görüntüleyin ve yüksek hızlı bir kamera ile her odak düzleminde iki boyutlu görüntüler yakalayın.

Uygun yazılımı kullanarak, bu görüntüleri bir z-yığını oluşturmak için birleştirin - hücre yüzeyi reseptörü-ligand etkileşiminin uzay-zamansal dinamiklerini gösteren yüksek çözünürlüklü dört boyutlu bir görüntü.

LLSM banyosuna 10 mililitre su ve 30 mikrolitre floresein ekleyin. İlk olarak, nesneyi görüntü konumuna taşımak için Görüntü (Ana Sayfa) düğmesine basın ve tek bir damar lazer ışını desenine bakın.

Işını her yönde dengelenmiş ince bir desen haline getirmek için kılavuzu ve önceden ayarlanmış ilgi alanını kullanarak lazer ışınını hizalayın. Işın ayrıca bulucu kamerada odaklanmış görünmelidir. Işını ayarlamak için iki ayna eğim ayarlayıcısını, üst odak mikrometresini ve objektif rengini kullanın.

Daha sonra, herhangi bir floreseini tamamen çıkarmak için banyoyu ve hedefleri en az 200 mililitre su ile yıkayın.

Standart floresan boncukları görüntülemek için, 'X Galvo Aralığı' kutusunda 3'e ayarlayarak Renk Taklidi açın ve mevcut alanı görüntülemek için Canlı'ya basın. En yüksek gri değerleri için eğim aynasını, objektif rengini ve odak mikrometresini manuel olarak ayarlayın. Ardından, objektif tarama, Z galvo, Z plus objektif ve örnek tarama yakalama modları için uygun desenleri elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Bundan sonra, eğriliği giderme ve evrişimi giderme için örnek nokta yayılma işlevini toplamak için Örnek Tarama Modunda Yürüt'e basın. Lazerleri üç renk moduna değiştirin ve tekrar Çalıştır'a basın.

Başlamak için, hazırlanan 5 milimetre çapındaki dairesel lamel üzerine 100.000 antijen sunan hücre ekleyin ve 10 dakika boyunca oturmalarına izin verin. Numune tutucuyu yağlayın ve lameli hücre tarafı yukarı bakacak şekilde ekleyin.

Ardından, lamel kağıdının arkasına bir damla görüntüleme ortamı ekleyin. Numune tutucuyu piezoya vidalayın ve Image (Ana Sayfa) düğmesine basın. Görüntülenecek antijen sunan bir hücre bulun ve LLSM ve görüntüleme yazılımının düzgün çalıştığından emin olun.

Geçerli görüntüyü görüntülemek için Canlı'ya basın. Lameli ve hücreleri bulmak için Z boyunca hareket edin. Z yönünde hareket ederek antijen sunan bir hücrenin merkezini bulun, ardından lazeri duraklatmak için Durdur'a basın. 3D'yi kontrol edin ve istediğiniz ayarları girin. Verileri toplamak için Enter tuşuna basın ve ardından Execute tuşuna basın.

Sahneyi Yük konumuna indirin ve görüntüleme ortamına 50 mikrolitre T hücresi ekleyin, damla damla doğru, doğrudan lamel üzerine. Pipet ucunun ucunda bir damla oluşmasına izin vermek ve ardından ucu banyo sıvısına değdirmek en iyisidir. Görüntü (Return) öğesine tıklayarak sahneyi geri kaldırın.

Görüntülemeye başlayın. İstenen Z yığınını ve timelapse uzunluğunu ayarladığınızdan emin olun. Örneğin, 0,4 mikrometrelik bir adım boyutunda 60 Z yığını oluşturun ve 500. zaman dilimlerini girin. Foto ağartmayı önlemek için 500 kareye ulaşılmadan önce kaydı durdurun. Hücre çiftlerini aramak için Canlı modu kullanın ve hazır ve istenen ayarlar girildiğinde, verileri toplamak için Yürüt'e basın.