Hücre Zarı Üzerindeki Nanoçubukların Difüzyon Dinamiğini Görselleştirmek için Darkfield Mikroskobu

Karanlık alan mikroskobu kullanarak canlı bir hücre zarı üzerindeki altın nanoçubuk difüzyon dinamiklerini araştırmak için, DFM, tek parçacık izleme ile birlikte, uygun ortam içeren bir kültür kabında sterilize edilmiş bir lamel ile başlar. Hücre süspansiyonunu lamel üzerine ekleyin. Ortam hücre büyümesini kolaylaştırır.

Elektrostatik etkileşimler yoluyla negatif yüklü hücre zarına adsorbe olan pozitif yüklü altın nanoçubuklarla inkübe edin. Ortamı tabaktan bir cam slaytın oluğuna pipetleyin. Lameli hücresi aşağı bakacak şekilde oluğa yerleştirin ve kapatın.

Slaytı karanlık alan mikroskobu aşamasına yerleştirin. Mikroskop, numuneyi özel bir karanlık alan kondansatöründen geçen yüksek açılı eğik bir ışıkla aydınlatır.

Nanoçubukların aydınlanması üzerine, nanoçubuk yüzeyindeki serbest elektronlar, gelen ışıkla rezonansa giren bir frekansta salınır. Salınım yapan elektronlar, objektif mercek tarafından yakalanan belirli bir dalga boyunda ışığı saçarak nanoçubuk görselleştirmesini mümkün kılar.

Benzer şekilde, lipitler ve proteinlerden oluşan hücre zarı, gelen ışığı çevreleyen ortamdan daha yüksek bir kırılma indisiyle dağıtır ve karanlık bir arka plana karşı parlak bir görüntü oluşturur. Zaman serisi DFM görüntülerini yakalayın.

Uygun bir yazılım kullanarak, nanoçubukların hücre zarından difüzyonunu yüksek uzay-zamansal çözünürlükle görselleştirmek için DFM görüntüleri üzerinde tek parçacık izleme analizi yapın.

Alevde etanole batırılmış bir cam lamel yakarak ve lameli fenol kırmızısı içermeyen 2 mililitre hücre kültürü ortamı içeren 35 x 10 milimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirerek başlayın. Lamel üzerine 50 mikrolitre ilgili hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için tabağı hafifçe ileri geri ve sola ve sağa sallayın.

Tabağa 20 mikrolitre CTAB kaplı altın nanoçubuk eklemeden önce, hücreler %20 ila %40 birleşmeye ulaşana kadar çanağı yaklaşık 12 saat hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Nanoçubukları tabağa eşit şekilde dağıtmak için hafifçe salladıktan sonra, tabağı 5 dakika boyunca nemli bir atmosfere koyun.

Kuluçka işleminin sonunda, 100 mikrolitre süpernatanı çanaktan yavaşça bir cam slaytın oluğuna aktarın ve lamel hücresini aşağı bakacak şekilde slayt oluğuna dikkatlice yerleştirin. Ardından, lamel kenarını oje ile kapatın ve slaytı karanlık alan mikroskobu aşamasına yerleştirmeden önce ojenin kurumasını bekleyin.

Karanlık alan mikroskobu ile tek parçacık takibi için, yağa batırılmış karanlık alan kondansatörüne bir damla yağ koyun ve kondansatör cam sürgüye temas edene kadar düğmeyi çevirin. Kapak camının üstüne bir damla yağ damlatın ve 60x yağa daldırma objektifi yağa değene kadar odaklama düğmesini çevirin.

Işık kaynağını açın ve görüntüleme düzlemini odaklamak için odaklama düğmesini hafifçe çevirin. Ardından, renkli CMOS kamerayı kullanarak bir örnek saçılma ışığı görüntü zaman serisini kaydetmek için mikroskop yazılımındaki kamera simgesine tıklayın ve görüntüyü TIFF formatında kaydedin.

Tek bir uzun vadeli yörünge çıkarmak için görüntüyü ImageJ'de açın ve görüntüyü RGB modundan 8 bit moduna dönüştürmek için Görüntü | Tür | ve 8 bit'e tıklayın. Kontrastı ayarlamak için Görüntü | Ayarla | Parlaklık | Kontrast'ı tıklatın ve parametreleri ayarlayın. Bir hedef parçacık seçin ve zaman serisi arka planını kesmek için "Control + X" tuşlarını kullanın.

Parçacık algılama ve parçacık bağlama penceresini açmak için Eklentiler | Particle Tracker Classic | ve Particle Tracker'a tıklayın ve yarıçapı 6'ya, kesmeyi 0'a ve yüzdelik dilimi %0,01'e ayarlayın. Bağlantı aralığını 10'a ve yer değiştirmeyi 10'a ayarlayın ve sonuçları görmek üzere parçacık izleyici sonuçları penceresini açmak için "Tamam"a tıklayın.

Oluşturulan yörüngeleri incelemek için "Tüm Yörüngeleri Görselleştir"e tıklayın. Yazılım tarafından oluşturulan yörünge ve altın nanoçubukların hareketli yörüngesi eşleşiyorsa, sonuçları kaydetmek için "Tam Raporu Kaydet"e tıklayın. Yazılım tarafından oluşturulan yörünge, altın nanoçubukların hareketli yörüngesiyle eşleşmiyorsa, tespit edilen parçacıkları farklı bağlantı aralığı ve yüzdelik parametrelerle yeniden bağlamak için "Parçacıkları Yeniden Bağla"ya tıklayın.