İnsan İskelet Kaslarında Glikojen Dağılımını Ölçmek için Transmisyon Elektron Mikroskobu

Dallanmış bir glikoz polimeri olan glikojen, insan iskelet kası içindeki hücre altı intermiyofibriller, intramiyofibriller ve subsarkolemmal bölmelerde bir enerji rezervidir.

Transmisyon elektron mikroskobu, TEM kullanarak hücre altı glikojen dağılımını ölçmek için izole edilmiş insan iskelet kası dokusu elde edin. Doku yapısını korumak için glutaraldehit ile sabitleyin. Dokuyu bir osmiyum tetroksit ve potasyum ferrosiyanür çözeltisi içinde sabitleyin.

İndirgenmiş osmiyum-ferrosiyanür kompleksi, glikojendeki hidroksil gruplarına bağlanarak glikojen partiküllerinin kastaki kontrastını iyileştirir. Ek olarak, zarlar ve zara bağlı bir organel olan sarkoplazmik retikulum lekelenir.

Dokuyu artan etanol konsantrasyonlarında kurutun. Katı bir blok oluşturarak reçineye gömün. Uzunlamasına yönlendirilmiş kas lifleri ile ultra ince kesitler elde edin; TEM ızgaralarına aktarın.

Izgaraları uranil asetat, ağır metal çözeltisine daldırın. Uranil iyonları negatif yüklü lipitlere ve proteinlere bağlanarak onları elektron yoğun hale getirir. Kurşun sitrat çözeltisi ile lekeleyin.

Kurşun iyonları, glikojen parçacıkları da dahil olmak üzere osmiyum lekeli bölgelere bağlanarak kontrastı arttırır. Ayrıca uranil asetatla reaksiyona giren bölgelere bağlanarak elektron opaklığını yoğunlaştırırlar.

TEM görüntüleme sırasında, elektron ışınları dokudan geçerken, glikojen de dahil olmak üzere lekeli elektron yoğun bölgeler daha fazla elektron saçarken, lekelenmemiş bölgeler elektronları iletir.

Üretilen yüksek kontrastlı TEM görüntüsünde, glikojen parçacıkları belirgin ve koyu görünür; lekelenmemiş bölgeler daha açık görünür, bu da kastaki hücre altı glikojen dağılımının görselleştirilmesini ve ölçülmesini kolaylaştırır.

Herhangi bir yönde maksimum 1 milimetre çapa sahip olan ve enine kesitten uzunlamasına daha uzun olan kas biyopsisinden veya tüm kastan küçük bir örneği izole edin.

Numuneyi soğuk birincil fiksasyon solüsyonunu içeren tüpe yerleştirin. 24 saat boyunca 5 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, numuneyi 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 4 kez yıkayın. Transfer pipetlerini kullanarak, kullanılmış tamponu tüpten çıkarın, numuneye dokunmadan bırakın ve yeni tamponu ekleyin. Numuneyi% 1 osmiyum tetroksit ve% 1.5 potasyum ferrosiyanür ile 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 4 santigrat derecede 120 dakika boyunca sabitleyin.

Numuneyi oda sıcaklığında çift damıtılmış suda iki kez durulayın. Oda sıcaklığında kademeli bir etanol serisine batırarak dehidre edin. Numuneyi, belirtilen hacim oranlarını kullanarak oda sıcaklığında propilen oksit ve epossidik reçine dereceli karışımlarla sızdırın.

Ertesi gün, numuneleri kalıplara% 100 taze epossidik reçine içine gömün ve 48 saat boyunca 60 santigrat derecede polimerize edin.

Bir numunenin bloğunu ultramikrotom tutucusuna monte edin. Doku seviyesine ulaşmak için yüzeydeki bloğu bir tıraş bıçağıyla kesin. Numunenin önüne bir elmas bıçak monte edin ve numune yüzeyini bıçağa paralel olarak hizalayın.

Numunenin yönünü kontrol etmek için elmas bıçakla 1 mikrometre kalınlığında yarı ince bir kesit üretin. Işık mikroskobu ile gözlem yapmak için yarı ince bölümü toluidin mavisi ile boyayın. Ardından, uygun ultra ince kesitler elde etmek için ilgi alanını azaltmak için bloğu daha da kırpın.

İkinci bir elmas bıçakla 60 ila 70 nanometre kalınlığında ultra ince kesitler kesin. Perfect Loop kullanarak tek delikli bakır ızgaralarda 1 ila 2 bölüm toplayın. Bölümleri kontrast yapmak için, ızgaraları 20 dakika uranil asetat çözeltisine batırın ve ızgaraları çift damıtılmış suda yıkayın ve ardından ızgaraları 15 dakika kurşun sitrat içine daldırın ve ızgaraları çift damıtılmış suda tekrar yıkayın.

Transmisyon elektron mikroskobunu, bilgisayarı ve görüntü kayıt yazılımını açın. Dijital yavaş taramalı CCD kamera ve ilgili görüntüleme yazılımı ile dijital görüntüler kaydedin. Mikroskop aşamasında birden fazla kesitli ızgarayı yerleştirdikten sonra, en kaliteli bölümleri seçmek için ızgarayı başlangıçta düşük büyütmede tarayın ve kas liflerinin yönünü belirleyin.

Ardından, görüntüyü 30.000'in üzerindeki büyütme oranlarında, ışın bölümdeki çevresel bir fiber üzerinde ortalanmış olarak odaklayın ve istenen büyütmede 1 saniye pozlama süresine sahip görüntüleri kaydedin. Tarafsız sonuçlar elde etmek için görüntülerin fiberin uzunluğu ve genişliği boyunca randomize, ancak sistematik bir sırayla dağıtıldığından emin olun ve 6 ila 10 fiber görüntülenene kadar görüntülemeyi tekrarlayın.

Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak görüntüleri imageJ'ye aktarın. Analiz Et'e tıklayarak genel ölçeği görüntünün orijinal boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın ve ardından Ölçeği Ayarla'ya tıklayın. %100 yakınlaştırmak için Görüntü'ye tıklayın, Yakınlaştır'a gidin ve İçeri'ye tıklayın.

Araçlar menüsündeki Düz Çizgi aracını kullanarak miyofibriller boşluğun görüntüsü başına bir Z diskinin kalınlığını ölçün ve 6 ila 10 fiberin her birinin ortalama Z disk kalınlığını hesaplayın. Subsarkolimal bölgenin hemen altında görülebilen en dıştaki miyofibrilin uzunluğunu ölçmek için Segmentli Çizgi aracını kullanın.

Izgara eklemek için Çözümle'ye tıklayın, Araçlar'ı seçin ve ardından Izgara'yı seçin. Şimdi Nokta Başına Alanı 32.400 nanometre kare olarak ayarlayın. Bir haçın subsarkolimal glikojene çarptığı 12 subsarkolimal görüntüde, mevcut uzunluk içindeki isabet sayısını sayın.

Analiz Et'e tıklayarak bir ızgara ekleyin, ardından Araçlar'ı ve ardından Izgara'yı seçin ve Nokta Başına Alanı 160.000 nanometre kare olarak ayarlayın. Bir çarpı işaretinin intramiyofibrillar boşluğa çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın.

Ardından, bir ızgara eklemek için Analiz Et'e tıklayın, Araçlar'ı seçin ve ardından Izgara'yı seçin. Şimdi, Nokta Başına Alanı 3.600 nanometre kare olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın.

Analiz Et'e tıklayarak bir ızgara ekleyin, ardından Araçlar'ı ve ardından Izgara'yı seçin ve Nokta Başına Alanı 32.400 nanometre kare olarak ayarlayın. Bir haçın intermiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın.

Glikojen parçacıklarını rastgele seçmek için 32.400 nanometre karelik ızgarayı kullanarak, sol üst kareden başlayın ve gerekirse sola hareket edin. Düz Çizgi aracını kullanarak, lif başına havuz başına ortalama 60 parçacık elde etmek için 12 görüntünün her biri için her havuzun rastgele seçilmiş 5 glikojen parçacığının çapını ölçün.