Mikrovasküler Trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu

İntravital floresan mikroskobu, bir mikrovasküler yaralanma bölgesinde bir trombüs - bir kan pıhtısı - oluşumunun fototoksik indüksiyonunu incelemek için yararlıdır.

Fototoksik florofor etiketli polisakkarit enjekte edilmiş anestezi uygulanmış tüysüz bir fare alarak başlayın. Uygun kan dolaşımı için fizyolojik sıcaklığı korumak üzere fareyi bir ısıtma platformuna yüzüstü pozisyonda yerleştirin.

Kulağın apikal kısmını intravital floresan mikroskobu altına yerleştirin. Işıkla uyarıldığında, florofor floresan yayar ve mikrovasküler kan akışının izlenmesine izin verir. Trombüs oluşumunu indüklemek için ışık yoğunluğunu arttırın.

Florofor, yüksek yoğunluklu ışığı emer ve reaktif oksijen türleri oluşturmak için moleküler oksijenle reaksiyona girer. Bu moleküller endotel hücrelerinde oksidatif strese neden olur, böylece hücre hasarına ve subendotelyal matrisin açığa çıkmasına neden olur.

Hasarlı hücreler, subendotelyal matrikste açıkta kalan kollajeni ve spesifik reseptörler aracılığıyla aracılara bağlanan dolaşımdaki trombositleri köprüleyen trombotik mediatörleri serbest bırakır.

Bağlanma, trombositleri aktive ederek, dolaşımdaki diğer trombositleri aktive eden ve yaralanma bölgesine toplayan efektör moleküllerin salınmasına neden olur. Dolaşımdaki fibrinojen proteinleri, aktive edilmiş trombositler üzerindeki fibrinojen reseptörlerine bağlanır ve bunları bir trombosit tıkacı oluşturmak üzere bağlar.

Trombüs oluşumunun birincil basamağı olan trombosit tıkacını doğrulamak için kısıtlı kan akışını görselleştirin.

Hayvanı stereomikroskop altındaki platforma yerleştirin. 10X büyütme kullanın. Sağ kulağın mikroskobu için, önce boynun derisinde kranyokaudal yönde 5 milimetrelik bir kesi oluşturarak sol juguler veni hazırlayın. Ardından, deri altı dokusunu incelemek için mikro forseps ve mikro makas kullanın. Ardından, damara dokunmadan damarı adventitia'sından kurtarın.

Şimdi, floresan boyanın enjeksiyonu için önceden hazırlanmış insülin şırıngasını kullanın. Damarı delmeden damar duvarını mikro forseps ile dikkatlice kavrayın. Şırınga iğnesi ile şişmiş damar duvarına nüfuz edin ve intravenöz olarak FITC-dekstran enjekte edin. İğneyi geri çekin ve pamuklu çubuklar kullanarak kanamayı durdurun. Kulağın kan ve boya kontaminasyonundan kaçının.

Isıtma plakası üzerindeki hayvanı, ısıtma plakası için bir yuva ve kulağı konumlandırmak için 0,5 santimetre yüksekliğinde bir düzlem ile akral bir cam konstrüksiyona aktarın. Yapışkan bandaj kullanarak hayvanı ısıtma plakasına yüzüstü pozisyonda sabitleyin. Dışbükey kıkırdağı kulağın tabanına, kulak düzleminin yanına yerleştirin, böylece kulağın apikal kısmı düzlem üzerinde düz bir şekilde konumlandırılabilir. Akral cam tabağa bir damla oda sıcaklığında su ekleyin. Pamuklu çubuklar kullanarak su damlasını emdirin ve kılcal kuvvetlerin kulak düzlemini akral cama bağlamasına izin verin.

Kıkırdak kulak kepçesine dışbükey bir şekil verse bile, kulak kepçesi mümkün olduğunca düz bir şekilde konumlandırılmalıdır. Bu nedenle, kulak kepçesinin sadece daha esnek olan distal kısmı akral cam plaka üzerine yerleştirilmelidir. Doku hasarını ve donmuş boyanın ekstravazasyonunu önlemek için, kulağa forseps ile mümkün olduğunca az dokunun.

Ardından, kulağın dışbükey dorsal tarafına bir damla su ekleyin. Kulağa giren bazal damarları sıkıştırmadan kulağın üzerine dikkatlice bir lamel koyun. Lamel ile kulak hedef damarları arasındaki mesafeyi en aza indirmek için, lamel altından mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için pamuklu çubuklar kullanın.

FITC-dekstran görselleştirme için intravital floresan mikroskobunu ayarlayarak başlayın. Hazırlanan hayvanı intravital floresan mikroskobunun masasına aktarın. 5X, 10X ve 20X büyütme ve %20 ışık yoğunluğu kullanarak, 50 ila 60 mikron çapında ve anterograd kan akışı olan bir venöz damar arayın.

63X büyütme objektifinin suya daldırılması için lamele bir damla oda sıcaklığında su ekleyin. Su damlasının uygulanmasından hemen sonra, çapın ve kan akışının temel değerlendirmesi için damarı 20 saniye boyunca kaydetmeye başlayın. FITC-dekstran enjeksiyonundan 5 dakika sonra trombüs indüksiyonunu başlatın. Bunun için ışık yoğunluğunu %100'e yükseltin.

Fototoksik trombüs indüksiyonu sırasında, kan akışının tıkanıp tıkanmadığını kontrol etmek için mikroskobun açıklığını 30 saniyelik bir süre içinde 2 saniye kapatın. Kan akışı devam ederse, açıklığı tekrar açın. Akış 30 saniye veya daha uzun süre hareketsiz kalırsa veya kan akışı retrograd ise damar tıkalı olarak sınıflandırılır. FITC-dekstran enjeksiyonundan sonra 1 saatlik bir süre içinde kulak başına beş damar seçin ve kapatın.