DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

DNA çift sarmallı kopmada spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini görselleştirmek için, immünofloresan mikroskobu kullanan DSB bölgeleri, DSB'li insan mononükleer hücre tek katmanlarını içeren mikroskop slaytları ile başlar. Hücreleri paraformaldehit ile sabitleyin.

Hücre içi hedeflere erişmek için iyonik olmayan bir deterjan, geçirgen zarlar ile muamele edin. Hücrelerin spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eden protein içeren bir bloke edici çözelti ekleyin. Hedef yanıt proteinlerine bağlanan birincil antikorlarla inkübe edin.

Proteinlere bağlı ilgili birincil antikorlarına spesifik olarak bağlanmak için farklı floroforlarla etiketlenmiş ikincil bir antikor karışımı ile tedavi edin. DNA'yı DAPI ile boyayın. Montaj ortamı ekleyin; lamel monte edin.

Floresan mikroskobu sırasında, gelen ışık huzmesi uyarma filtresine ulaşır ve belirli bir uyarma dalga boyundaki ışığın geçmesine izin verir. Dikroik aynaya - bir ışın ayırıcı - ulaştıktan sonra, uyarma ışığı seçici olarak objektif merceğe doğru yansır ve bu da ışığı numuneye odaklar.

Gelen uyarma ışığı, floroforun elektronlarını daha yüksek bir enerji durumuna uyarır. Temel duruma döndüklerinde, elektronlar daha uzun bir dalga boyunda ışık yayar, objektif mercek tarafından toplanır ve dikroik aynaya geri geçer.

Ayna, yayılan floresan ışığının emisyon filtresinden geçmesine izin verir, bu da sadece istenen floresan ışığının dedektöre ulaşmasını sağlar. Görüntüleri işleyin. DSB bölgesindeki DNA hasar yanıt proteinlerinin birlikte lokalizasyonunu görselleştirmek için farklı renkli floresan odaklarını analiz edin.

Her preparat için 1 x 10⁵ hücrenin santrifüjlenmesi ile hasta örneklerinin mononükleer hücreleri ile iki sitospin hazırlayın. Hücreleri 200 mikrolitre% 4 PFA ile 10 dakika boyunca sabitleyin.

Fiksasyondan sonra, hücreleri bir çalkalayıcı üzerinde her biri beş dakika boyunca 30 mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, hücrelere 10 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.1 Oktosinol-9 geçirgen. Hücreleri, bir laboratuvar çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 30 mililitre% 5 bloke edici solüsyon ile üç kez nazikçe yıkayın. Hücreleri bir saat boyunca 30 mililitre taze% 5 bloke etme solüsyonunda bloke edin.

Hücrelerin %4 paraformaldehit ve %0.1 Oktosinol-9 ile fiksasyonu ve geçirgenliği, gama H2AX ve 53BP1 odaklarını belirgin bir şekilde korumuştur.

Hücrelerin bir preparatını bir fare monoklonal anti-gama H2AX antikoru ile ve hücrelerin diğer preparatını bir fare monoklonal anti-gama H2AX antikoru ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikoru ile gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Kanıtlanmış anti-gama H2AX ve anti-53BP1 antikorlarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

İnkübasyondan sonra, hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcıda her beş dakika boyunca 30 mililitre% 2 bloke edici solüsyon ile üç kez nazikçe yıkayın.

Daha sonra, hücrelerin ilk hazırlığını,% 2 bloke edici çözeltide 500'de 1 oranında seyreltilmiş bir Alexa488 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru ile inkübe edin. Hücrelerin ikinci preparasyonunu bir Alexa488 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru ve bir Alexa555 konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikoru% 2 bloke edici çözelti içinde 500'de 1 oranında seyreltilmiş bir inkübe edin.

Hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcısında 30 mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri montaj ortamıyla monte edin. Dikkatli bir şekilde, hava kabarcığı oluşmaması için montaj ortamının üzerine bir lamel koyun. Hücreleri floresan mikroskobu ile analiz etmeden önce montaj ortamının sertleşmesi için en az üç saat bekleyin.

Son olarak, 2x objektif büyütmede görüntüleme sırasında DAPI, Alexa488 ve Cy3 için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu ile hücre çekirdeğindeki gama H1AX ve 1BP100 odaklarını analiz edin.