Proteinlerdeki Çoklu Fosforilasyonları Tanımlamak için Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Bir proteindeki çoklu fosforilasyonlar, proteine çeşitli pozisyonlarda, özellikle serin ve treonin kalıntılarında fosfat gruplarının eklenmesini içerir.

Bir proteindeki çoklu fosforilasyonları tanımlamak için, amid hidrojenleri proteindeki diğer hidrojenlerden ayırt etmeye yardımcı olan nitrojen-15 ile etiketlenmiş fosforile proteinler içeren bir tüp ile başlayın.

Bağıl rezonans frekanslarının doğru ölçümü için dahili bir NMR referans bileşiği ekleyin. Karışımı bir nükleer manyetik rezonans veya NMR tüpüne aktarın. Tüpü dönen bir açıklığa yerleştirin ve bir NMR spektrometresine yerleştirin.

Fosfatların varlığı, fosforile serin ve treonin kalıntılarında elektron çekme etkileri gösterir. Sonuç olarak, fosforile kalıntıların amid hidrojenleri, diğer amid hidrojenlerine kıyasla daha düşük elektron yoğunlukları ile deshielded gibi görünmektedir.

Değişen elektronik ortamlara sahip amid hidrojenler, çekirdeklerin etrafında diferansiyel manyetik alanlar yaşar ve düşük enerjili durumlara ulaşır.

Hidrojen çekirdeklerini, elektronik ortamlarına bağlı olarak belirli bir rezonans frekansında daha yüksek bir enerji durumuna uyarmak için kısa bir radyofrekans darbesi uygulayın.

Gevşeme sırasında çekirdekler, bir NMR sinyali ürettiği tespit edilen emilen enerjiyi serbest bırakarak düşük enerjili bir duruma geri döner.

Tek tek amid hidrojenlerini temsil eden iki boyutlu bir NMR spektrumu çizin.

Fosforile proteinin spektrumunu fosforile olmayan proteinin spektrumu ile karşılaştırın. Fosforile proteinin NMR spektrumunda ek rezonansların ortaya çıkması, çoklu fosforilasyonları doğrular.

4 miligram liyofilize ¹⁵N ve ¹³C ile zenginleştirilmiş ERK-fosforile Tau'yu 400 mikrolitre NMR tamponunda çözündürün. NMR spektrometresinin alan blokajı için %5 döteryum oksit ve dahili bir NMR sinyal referansı olarak 1 milimolar TMSP ekleyin. Ayrıca, tam bir proteaz inhibitörü kokteylinin 40x stok çözeltisinden 10 mikrolitre ekleyin.

Numuneyi, uzun iğneli elektronik bir şırınga veya bir Pasteur pipeti kullanarak 5 mililitrelik bir NMR tüpüne aktarın. Pistonu kullanarak NMR tüpünü kapatın. Pistonu hareket ettirerek piston ile sıvı arasında sıkışan hava kabarcıklarını çıkarın.

NMR tüpünü bir döndürücüye yerleştirin. Numune çözeltisinin çoğu NMR bobininin içinde olacak şekilde, döndürücüdeki dikey konumunu ayarlamak için uygun ölçüyü kullanın. Ardından, mıknatıs kontrol sistemi penceresindeki "Kaldır"a tıklayarak NMR cihazındaki hava akışını başlatın. Döndürücüyü, tüp ile birlikte mıknatıs deliğinin üst kısmındaki hava akışına dikkatlice yerleştirin, ardından hava akışını durdurun ve tüpün mıknatıs içindeki prob kafasının içindeki yerine inmesine izin verin.

Numunenin 25 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verdikten sonra, güç aktarımını optimize etmek için prob kafasının yarı otomatik olarak ayarlanmasını ve eşleştirilmesini gerçekleştirmek için komut satırına 'atmm' yazın. Ardından, spektrometrenin alan frekansı kilidini devreye sokmak için mıknatıs kontrol sistemi penceresindeki "Kilitle"ye tıklayın.

Numunenin konumundaki manyetik alanın homojenliğini optimize etmek için, önce şim penceresini açmak için komut satırına 'topshim gui' yazarak şim oluşturma prosedürünü başlatın. Ardından, dolgu penceresinde "Başlat" ı tıklayın. Şimlerin optimal olduğunu doğrulamak için kalan B sıfır standart sapmasını kontrol edin.

Ardından, bir proton radyo frekansı darbesinin mikrosaniye cinsinden uzunluğu olan P1 parametresini kalibre edin. Bu parametre, proton spin manyetizasyonunun 90 derecelik bir dönüşünü elde etmek için gereklidir. Tek boyutlu bir su protonu spektrumu kullanarak 360 derecelik darbeyi hedefleyin.

01 parametresini tek boyutlu spektrumdaki proton su frekansına ayarlayarak frekans ofsetini ayarlayın. Son olarak, komut satırına 'zg' yazarak tek boyutlu bir proton spektrumunun edinimini başlatın.