DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Dairesel Dikroizm Spektroskopisi Tekniği

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 4:38 dk • July 8th, 2025

ATP'ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme proteinleri, DNA konformasyonunu ATP'ye bağımlı bir şekilde değiştirerek sıkıca paketlenmiş kromatinde gen ekspresyonunu düzenler.

Dairesel dikroizm veya CD spektroskopisi kullanarak kromatin yeniden modelleyici-DNA etkileşimlerini incelemek için, çift sarmallı DNA oligonükleotidlerinin bir çözeltisini alın. Oligonükleotidleri denatüre etmek için ısıtın ve buzun üzerine yerleştirin.

Hızlı soğutma, ikincil yapılar oluştururken DNA'nın yeniden doğasına neden olur. Çift ila tek iplikli geçiş bölgesi, kromatin yeniden modelleyicileri için optimum bir bağlanma bölgesi sağlar.

Isıyla soğutulmuş DNA'yı bir küvete ekleyin. ATP'ye bağımlı kromatin yeniden şekillendirici, ATP ve magnezyum iyonları içeren bir tampon ekleyin.

Yeniden şekillendirici DNA'ya bağlanır, ardından magnezyum iyonu kompleksli ATP'nin proteine bağlanması ve onu aktive etmesi gelir. Aktive edilmiş yeniden şekillendirici, ATP'yi hidrolize eder - DNA'da bir kök döngü konformasyonunu indükler.

Numuneden sol ve sağ dairesel polarize ışığı - 90 ° faz farkıyla - geçirin. Optik olarak kiral DNA, sol ve sağ dairesel polarize ışığı farklı derecelerde emer.

Dairesel dikroizm olarak adlandırılan diferansiyel absorpsiyon, iletilen ışığın eliptik olarak polarize olmasına neden olur ve bu da eliptiklik olarak ölçülür. CD spektrumlarındaki belirli dalga boylarında iki pozitif tepe noktası, kök döngü yapısını doğrular.

ATPaz aktivitesini inhibe ederek magnezyum iyonlarını şelatlamak için EDTA ekleyin.

Şelasyon üzerine CD spektrumlarındaki bir değişiklik - belirli dalga boylarında negatif bir tepe ve geniş bir pozitif tepe gösterir - ATP hidrolizinin yokluğunda kök döngü konformasyonunun bozulmasını gösterir.

CD spektrumlarını yüksek şeffaflıkta kuvars küvetlerde toplayın. Dikdörtgen veya silindirik küvetler kullanın. Küvetleri temizlemek için birkaç kez suyla yıkayın, ardından temiz olup olmadığını kontrol etmek için küvetteki suyu veya tamponu tarayın.

Reaksiyonlar için PAGE ile saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın. Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda 3 dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın ve hemen buz üzerinde soğutun. Yavaş soğutma için, DNA'yı 94 santigrat derecede 3 dakika ısıttıktan sonra, dakikada 1 santigrat derece oranında oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

Temel spektrumları kaydetmek için, 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerinde tek tek toplam 5 kontrol reaksiyonu ayarlayın. Tüm reaksiyonlarda reaksiyon hacmini 300 mikrolitrede tutun.

CD spektrumlarını kaydetmek için, 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde tek tek toplam beş deneysel reaksiyon ayarlayın.

Taramayı kaydetmek için gazı açın ve CD spektrometresini açın. 10 ila 15 dakika sonra lambayı açın, su banyosunu açın ve tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Ardından, CD spektrum yazılımını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye, dalga boyu aralığını 180 ila 300 nanometreye, nokta başına süreyi 0,5 saniyeye ve tarama sayısını 5'e ayarlayın. Ardından, Pro-Data Viewer'a tıklayın, yeni bir dosya oluşturun ve deneyin ayrıntıları ve tarihi ile yeniden adlandırın.

Daha sonra, temel ve deneysel reaksiyonları pipetleme ile karıştırın ve reaksiyon karışımlarını hava kabarcığı olmadığından emin olarak teker teker küvete dikkatlice aktarın.

Bir zaman rotası deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gereken süre boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, taramayı yapın. ATP hidrolizini durdurmak için DNA, ATP, magnezyum ve protein içeren tampona EDTA ekleyin. ATPaz aktivitesini tamamen inhibe etmek için EDTA konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini arttırın.

Temelleri yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan çıkarın ve verileri CD spektrum yazılımında veya veri çizim yazılımında düzgünleştirin. Ardından, ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir dalga boyu grafiği çizin ve tepe noktalarını analiz edin.

09:40

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:37

Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:54

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:16

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:43

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:26

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:44

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:12

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:48

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:32

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026