Spesifik Bir Antijeni Tespit Etmek için Raman Spektroskopisi Tabanlı Doğrudan İmmünoassay

Muhabirlerin nanoparçacıklara bağlanması için Raman muhabir boya moleküllerini altın nanoparçacıklarla inkübe ederek başlayın.

Hedef antijene özgü polietilen glikol, PEG ile konjuge antikorlar ekleyin. Antikorlar, altın-disülfür bağlanması yoluyla nanopartiküllere kovalent olarak bağlanır. Kalan nanoparçacık bölgelerini bloke etmek ve nanoparçacık toplanmasını önlemek için tiyol konjuge PEG'ler ekleyin, nanoparçacık probları oluşturun.

İmmünoassay plakası kuyucuklarını hedef antijen ile kaplayın. Kalan plaka bölgelerini protein içeren bir çözelti ile bloke edin. Nanoparçacık problarını ekleyin. Kuyular boyunca seri prob seyreltmesi gerçekleştirin. Problardaki antikorların antijenlere bağlanarak kompleksler oluşturması için inkübe edin.

Probun optik tepkisini belirlemek için bir Raman mikroskobu kullanın. Gelen monokromatik lazer, altın nanopartiküllerin yüzey elektronlarını uyarır ve salınımlarına neden olarak prob yüzeyinde yüksek bir yerel elektromanyetik alan oluşturur.

Gelen ışın ve Raman raportörleri etkileşime girerek, gelişmiş elektromanyetik alan nedeniyle farklı dalga boyları ve frekanslarda gelişmiş esnek olmayan ışığa veya Raman saçılmasına neden olur. Esnek olmayan bir şekilde yayılan Raman sinyali, Raman spektrumunu oluşturmak için kullanılır.

Prob tespitinin alt sınırını bulmak ve antijenin daha hassas tespitini kolaylaştırmak için Raman raportör zirvesinin spektral alanını prob konsantrasyonuna karşı çizin.

Raman problarını hazırlamak için, önce iki adet 1,5 mililitrelik altın nanopartikül partisi ve Raman raportörünü ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi belirlenen konsantrasyonlarda yapın.

Bu, Raman raportörü ve altın nanoparçacık çözeltilerinin birleştirilmesi ve oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla bağlanmalarına izin verilmesiyle yapılır. Daha sonra, partiküllere 200'e 1'lik bir antikor oranı oluşturmak için PEGile antikor solüsyonunu, raportöre bağlı altın nanopartikül solüsyonlarından birine ekleyin. Bu çözüm test numuneleri için olacaktır.

Ayrı bir mikrosantrifüj tüpünde, kontrol olarak kullanılacak partiküllere 200 ila 1 oranında antijen oranında diğer raportöre bağlı altın nanopartikül çözeltisine bir PEGile antijen ekleyin. Her iki çözeltiyi de oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Ardından, nanopartikül yüzeyinde kalan bölgeleri bloke edin. Bunu başarmak için önce katı metoksi polietilen glikol tiyolu HPLC suyu kullanarak 200 mikromolar konsantrasyona çözün. Tiyol tamamen eriyene kadar çözeltiyi girdaplayın. Daha sonra, tiyol çözeltisini nanopartiküle bağlı PEG antikor çözeltilerine 40.000 ila 1 oranında ekleyin ve altın nanoparçacık üzerinde kalan bölgelerin bloke edilmesini sağlamak için çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, süpernatantın berrak olması için parçacıkları düşük bağlı santrifüj tüplerinde santrifüjleyerek işlevselleştirilmiş Raman problarını geri kazanın. Süpernatanı pipetleyerek çıkarın, ancak nanopartikülleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Ardından, nanopartikülleri 1 mililitre PBS ile yeniden süspanse edin.

Çözeltinin yaklaşık üç mikrolitresinden UV-Görünür bir ölçüm alarak altın nanopartikül konsantrasyonunu tahmin edin ve sonuçları, doğrusal bir ilişki olduğu için bilinen bir altın nanopartikül konsantrasyonundan elde edilen sonuçlarla karşılaştırın.

Nanopartiküller yeterince bloke edilmezse, partiküller arası yapışma kuvvetleri nedeniyle toplanırlar, bu da reaktiflerin yanlış konsantrasyonlarda eklendiğini düşündürür. Normalde, çözelti koyu kırmızı bir renktir, ancak toplama gri bir renk oluşturur.

Hacmi, nihai çözeltiler mililitrede en az 1 x 10¹¹ parçacık olacak şekilde ayarlayın ve çözeltileri, immünoassay plakasını işlevsel hale getirmek için kullanılana kadar 4 santigrat derecede saklayın. Bu çözümleri bir hafta içinde kullanın. İlk olarak, polistiren kuyularını doldurmak için yeterince seyreltilmiş antijen hazırlayın. Daha sonra, çözeltiyi girdaplayın ve çözeltiyi hemen plaka kuyularına ekleyin.

Antijenin oda sıcaklığında 1 saat boyunca plakalara bağlanmasına izin verin. Ardından, çözeltiyi boşaltarak ve plakayı kağıt havlu kaplı bir masaya vurarak fazla antijen çözeltisini çıkarın. Yüzeyi yıkamak için kuyucuklara TBST ekleyin. Ardından, solüsyonu tekrar boşaltarak ve plakayı kağıt havlu kaplı bir masaya vurarak yıkamayı çıkarın.

Daha sonra, plakanın her bir oyuğuna 70 mikrolitre HSA bloke edici çözelti ekleyerek ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için plaka üzerinde kalan bağlanma bölgelerini bloke edin. Ardından, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi plakayı TBST ile üç kez durulayın. Son durulamayı çıkardıktan sonra, plakayı örtün ve daha fazla kullanılana kadar 4 santigrat derecede kuru tutun.

Daha önce hazırlanmış olan 140 mikrolitre prob nanopartiküllerini 96 oyuklu bir plakanın ilk sütununa ekleyin, test nanopartiküllerini ilk beş sıraya ve kontrol nanopartiküllerini son üç sıraya yerleştirin. Diğer tüm sütunlara 70 mikrolitre PBS ekleyin.

Her sütunu 1 ila 2 seri seyreltme kullanarak seyreltin. İlk sütundan 70 mikrolitre alarak ve ikincisiyle karıştırarak başlayın. Ardından, ikinci sütundan 70 mikrolitre alın ve üçüncü sütuna ekleyin ve bu şekilde devam edin. Plakanın en az bir saat inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, bağlanmamış nanopartikül problarını çıkarın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi beş kez TBST ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 70 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı bir plaka contası ile örtün. Kontrol numunelerinin temiz olduğunu kontrol edin. Spesifik olmayan bağlanma meydana gelmişse, kontrol numuneleri, test numuneleri ile benzer bir renge sahip olacaktır.

Ters çevrilmiş bir Raman mikroskobu kullanarak, hedefi altın nanoparçacık problarının bulunduğu kuyunun yüzeyine odaklayın. Kuyunun Raman spektrumlarını elde edin. 1800 ters santimetre ile 400 ters santimetre arasında değişen bir spektrum toplayın ve bunu her kuyucuk için tekrarlayın. Son olarak, kurulumun hassasiyetini belirlemek için eşlik eden metin protokolünün son bölümündeki adımları izleyin.