Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

Bu prosedürün genel amacı, mycoplasma kontaminasyonunu saptamak için optimize edilmiş lookout mycoplasma PCR tespit kitinin kullanım adımlarını görsel olarak göstermektir. Bu işlem, öncelikle istenen şablonu PCR için uygunsuz hale getirebilecek DNA moleküllerini inaktive etmek amacıyla numunelerin 95 °C'ye kadar ısıtılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, nükleotidler, primerler ve iç kontrol DNA'sı ile önceden kodlanmış olarak sağlanan tüpler kullanılarak numuneler PCR için hazırlanır.

Prosedürün üçüncü adımı, en yüksek hassasiyeti sağlamak ve spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek için dikkatle optimize edilmiş koşullar altında sıcaklık döngüleme işlemidir. Nihayetinde, söz konusu örneklerin mycoplasma ile kontamine olup olmadığını belirlemek için agaroz jel elektroforezi ile değerlendirme yapılarak sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, reaktiflerin önceden hazırlanmış olması ve yüksek kaliteli PCR tüplerinin kullanılmasıdır.

Bu durum işlemi daha kolay ve verimli hale getirir. Bu kitin bir diğer avantajı da kontaminasyonu tespit etmek için mikrolitre başına örnekte iki mycoplasma genomundan daha azına ihtiyaç duymasıdır. Mycoplasma tespiti için işlem gerçekleştirilirken, ciltle teması minimuma indirecek uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanılmasına dikkat ederek olası tüm kontaminasyonlardan kaçınmak, kullanılan tüm reaktiflerin kontaminasyon içermediğinden emin olmak ve her zaman uygun aseptik tekniği sürdürmek önemlidir.

Prosedür ya doğrudan hücre kültürü süpernatantları üzerinde gerçekleştirilebilir ya da numuneler daha sonra kullanılmak üzere hazırlanabilir. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere hazırlamak için, her bir süpernatanttan 100 µL steril bir amplifikasyon tüpüne yerleştirin ve 95 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası numuneler, 2 ila 8 °C'de bir hafta boyunca saklanabilir.

Numuneleri test etmeden hemen önce, hücresel kalıntıları çöktürmek için kısa süreli santrifüj yapın. PCR için numuneleri hazırlamak adına öncelikle, reaksiyonlar için gereken toplam DNA polimeraz rehidrasyon tamponu hacmini belirleyin. Reaksiyon başına bir ünite DNA polimeraz, kullanılan tac'e göre değişkenlik gösterecek olan uygun hacimdeki rehidrasyon tamponuna eklenmelidir; bu gösterimde jumpstart TAC D 93 0 7 kullanılacaktır ve beş reaksiyon (üç numune, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol) gerçekleştirilecektir.

Hesaplanan hacimdeki DNA polimerazı temiz bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından hesaplanan hacimdeki rehidrasyon tamponunu ekleyin. DNA polimeraz rehidrasyon tamponunu, tüpe hafifçe vurarak nazikçe karıştırın. Bu karışımı vortekslemeyin.

Negatif kontrolü ve örnekleri hazırlamak için kit içerisinde verilen şeffaf reaksiyon tüplerini kullanın. Bu reaksiyon tüpleri halihazırda nükleotidleri, primerleri ve iç kontrol DNA'sını içermektedir; önceden hazırlanmış olan DNA polimeraz rehidrasyon tamponundan 23 µL ekleyin. Negatif kontrol ve örnek tüplerinin her birini karıştırın.

Ardından, negatif kontrole iki µL DNA içermeyen su ve her bir örneğin ilgili örnek tüplerine ikişer µL ekleyin. Tüpleri hafifçe sallayarak içeriği karıştırın. İçerik vorteksle karıştırılmamalıdır.

Pozitif kontrolü hazırlamak için kit içerisinde verilen pembe reaksiyon tüplerini kullanın. Bu reaksiyon tüpleri halihazırda nükleotidleri, primerleri ve internal kontrol DNA'sını içermektedir; reaksiyon tüpüne 25 µL DNA polimeraz rehidratasyon tamponu karışımı ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak içeriği karıştırın; içerik vorteksle karıştırılmamalıdır.

Ardından pozitif kontrol, negatif kontrol ve örnek tüplerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra tüm reaksiyon tüplerini bir termal döngüleyiciye aktarın. PCR için, 40 döngü boyunca aşağıdaki koşulları ayarlayın.

30 saniye boyunca 94 °C. 30 saniye boyunca 55 °C ve 40 saniye boyunca 72 °C. Jumpstart tak polymerase kullanıldığında aktivasyon basamağına gerek yoktur.

PCR döngüleri tamamlandığında, örnekleri termal döngüleyici cihazdan çıkarın ve dört ila sekiz santigrat dereceye soğumaları için buz üzerine yerleştirin. Örnekler daha sonra elektroforez için agaroz jele yüklenebilir; her bir PCR reaksiyonu için sekiz mikrolitreyi ayrı bir kuyucuğa doğrudan yükleyin. Yükleme tamponu ve boyası, reaksiyon tüplerinde halihazırda bulundukları için örnekler yüklenmeden önce eklenmelerine gerek yoktur.

Takip boyası 2,5 ila üç santimetre göç ettikten sonra elektroforezi durdurun. PCR ile mikoplazma tespitine ilişkin temsili sonuçlar, bu agaros jel hattı görüntüsünde gösterilmiştir. İki numaralı hat, yaklaşık 481 baz çiftinde bir bant göstermesi gereken negatif kontroldür.

481 baz çiftindeki negatif kontrol bandının yokluğu, kullanılan TAC'nin yeterince hassas olmadığının iyi bir göstergesidir. Mycoplasma pozitif numuneler, üçten altıya kadar olan şeritlerde gösterildiği gibi 270 artı veya eksi sekiz baz çifti aralığında bantlar gösterecektir. Bant, yüksek derecede kontamine olmuş numuneler için belirgin, hafif kontamine olmuş numuneler için ise sönük olacaktır.

Tüm örnekler, PCR'ın beklendiği gibi gerçekleştiğini göstermek için dahili bir negatif kontrol içerir. Çok yüksek düzeyde kontamine olmuş örneklerde dahili kontrolün görülmemesi normaldir. Yedinci şeritte gösterildiği gibi, hem pozitif hem de negatif aralıkta bandın yokluğu, örneklerin inhibe olduğunun iyi bir göstergesidir.

Örnek inhibe olmuşsa, DNA ekstraksiyonu yapılarak PCR inhibitörleri uzaklaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kit prosedüründe belirtilen tüm gerekli adımları nasıl uygulayacağınızın yanı sıra sonuçları nasıl yorumlayacağınız ve gerektiğinde sorunları nasıl gidereceğiniz konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.