Name: Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin Dugesia /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin planarya solucanlarında rejenerasyon testleri yapmayı ve farmakolojik veya genetik yöntemlerle manipüle etmeyi. Bu teknikler kök hücre farklılaşması ve rejeneratif biyoloji araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratuarda İş NSF (MCB0919933) ve NIH (GM088790) tarafından desteklenmektedir.

1. Trunk parçası rejenerasyon tahlil <ol><li> Hayvanların atık ve yutulur gıda (~ 30 bozulmamış solucanlar, her solucan ~ açlık sonrası 8-10 mm uzunluğunda) emin olmak için en az 5 gün önce rejeneratif tahlil için solucanlar bir kohort beslenme durdurun. </li><li> Testinin gününde, su ile önceden dondurulmuş tesviye buz bulaşık durulama ve plastik wrap ile düz buzlu bir yüzey kapağı. Forseps kullanarak, plastik ambalaj malzemesi ile bir filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Filtre kağıdı, kaynak suyu birkaç damla ile ıslatın. Planaryalar bir transfer pipet kullanarak filtre (filtre ortalama &lt;20 solucanlar) üzerine aktarın. Worms, gerekirse daha fazla kaynak suyu ile repipetting, filtre yeniden konumlandırılmış olabilir. Aşırı sıvı çıkarın. </li><li> Bir neşter kullanılarak, tek bir kesim hayvan ön apeks ve yutak (Şekil 1A) ön ucu arasında yaklaşık yarım baş organını. </li><li> Bir neşter kullanılarak, yaklaşık yarım kuyruk hayvan sonu ve yutak (Şekil 1A) arka ucu arasında yapılan tek bir kesim tarafından kuyruk bölgesi organını. Neşter kestikten sonra% 70 etanol ile ıslatılmış kağıt havlu ile aşırı mukus çıkarın. Neşter fazla etanol silin. </li><li> Kaynak suyu içeren bir Petri kabı (100 x 25mm derinlik) içine forseps aracılığıyla filtre aktarın. (Yaranın kapanması için, yara pinching ve koyulaşması tarafından gözlemlenebilir) ~ 3 dakika bekleyin. </li><li> Petri kabı içeren termostatlı inkübatör rejeneratif tahlil ve transfer (24 ° C) için istenen orta gövde parçalarının içine filtre kağıdı durulayın. </li><li> ~ 1 hafta sonra yeniden yapılar tanımlanabilir (Şekil 1A) Puan rejeneratif fenotipi. </li></ol> 2. Farmakolojik manipulasyon praziquantel tarafından uyarılan iki kutupluluk: rejenerasyon <ol><li> DMSO çözülebilmesinde ilaç (62.4mg PZQ 200mm hisse senedi için 1 ml) praziquantel (PZQ) stok hazırlayın. Aynı gün kullanın. </li><li> Tamponlu Montjuch tuzları ilaç içeren solüsyon (90 mcM PZQ) 50ml olun. ~ Dağılım sağlamak için 1 dakika karıştırın. </li><li> [Protokol # 1], son adım [1.7] PZQ gövde parçalarının bir kohort açığa, yukarıda ayrıntılı olarak gövde parçası rejeneratif tahlil gerçekleştirin. </li><li> 24-48 saat sonra, döviz PZQ içeren, kaynak suyu için medya solucanlar birkaç kez çamaşır (&gt; 3). </li><li> Inkübatör için solucanlar dönün. Puan iki kutupluluk (iki başkanları, Şekil 1B) bir hafta sonra kesme. </li></ol> 3. Rejenerasyon Genetik manipülasyon: in vivo RNAi besleme protokolü <ol><li> Önce tahlil, tavuk karaciğeri Homojenat hazırlar. Gıda stoklarının gelen yağ, sarı renkli bölümler, ve püresi kalan karaciğer atın. Depolama için örgü süzgeç ve alikotu süspansiyon (1.5mL tüpler, -20 ° C) süzülür püresi. </li><li> Tahlil için, önce 1mL örnekleri -20 ° C'de saklanan, arz aliquoting sığır kırmızı kan hücreleri (eritrositler) hazırlamak </li><li> RNAi için solucanlar seçin. Üç kohortlarında kullanılır: ilgi gen, pozitif kontrol (bilinen RNAi fenotip gen Şekil 1C, D &amp; E) ve negatif kontrol (hiçbir RNAi fenotip gen, aynı zamanda deneysel kohort göre demonte seviyelerinin değerlendirilmesi için yararlı). Her kohort için, ~ 250 solucanlar (en az 5 gün açlıktan sonra uzun ~ 8-10 mm) kullanın. Plastik küvet kaynak suyu saklayın. </li><li> Ilgi dsRNA hedef gen ifade E. coli her RNAi kohort, çözülme stok için [8], tavuk karaciğeri Homojenat bir tüp ile birlikte [3,1] ve eritrositlerde bir tüp [3,2]. </li><li> Pelet bakteriler (13.000 g, 1 dakika). Süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet 2xYT medya (~ 700μl) çıkarın. Recentrifuge buz üzerinde supernatant, yer pelet atmak. </li><li> Büyük bir delik P200 pipet ucu sonu keserek oluşturun. RNAi beslenme karışımı oluşturmak için tavuk karaciğeri Homojenat (150 mcL) ve eritrosit (50 mcL) oluşan bir karışım iyice bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Santrifüj hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Besleme için (~ 1 inç derinlikte terk) solucanları içeren plastik küvet suyun çoğunluğu çıkarın. Swirl küvet, solucanlar, bu kabın merkezinde konsantre ve solucanlar corralling bir daire içinde pipet RNAi beslenme karışımı. Diğer Diners rahatsızlık vermesini dikkatlice RNAi beslenme karışımı üzerine geri kaçakla koaksiyel bir transfer pipet kullanın! </li><li> Beslemeden sonra (~ 1 saat), iyi beslenen Planaryalar belirlemek. Bu solucanlar yutulur eritrositlerde koyu kırmızı bir renklenme gösterir. Diğerleri atın. </li><li> Dikkatle, taze bahar su ile çözüm beslenme, gıda egestion önlemek için rahatsızlığı en aza indirmek değiştirin. Bunu yapmak için, hafifçe bir tarafa transfer pipet kullanarak tüp, bulanık su dökmek ve dikkatli bir şekilde küvetin Karşı duvarda dökülen tatlı su ile değiştirin solucanlar yerelleştirmek. Resubmerge Planaryalar hızla havaya uzun süre maruz kalma olarak da gıda egestion sonuçları. </li><li> Gevşek seal konteyner kapağı ve kuvöz dönüş (24 ° C) </li><li> Rejeneratif döngüleri [protokol # 1] RNAi fenotipleri için ekran ile serpiştirilmiş çok sayıda döngüleri üzerinden RNAi besleme protokolü (~ 2-3 gün arayla), tekrarlayın. Şekil 2, toplam süresi yaklaşık 1 ay sürüyor, birçok genin etkili beslenme ve yenilenme için standart bir protokol gösterilmiştir . </li></ol> Optimum protokol mRNA stabilitesini, doku yerelleştirme, protein perdurance, ya da birden fazla besleme döngüleri rejenerasyon sonra önleyen bir fenotip gelişimi gibi faktörlere bağlı olarak, farklı genler için bu şemaya değiştirin. Sadece negatif kontrol kohort ile hedef mRNA düzeylerini karşılaştırmak için fenotipi (görünen eğer) penetrans tarama, veya qPCR yaklaşımlarla tarafından demonte seviyeleri değerlendirin. 4. Temsilcisi sonuçları: Gövde parçası rejenerasyon tahlil tüm solucanlar normal ön-arka ('baş-kuyruk) polarite ile yeniden gerektiği gibi sağlam. Bu kısa sürede, ön eyespots (asterixed Şekil 1A) ortaya çıkması kolaylaştırılmış kesme beş gün sonra, atılır . Ancak, kayıp yapıların morfolojik restorasyon tam bir hafta sonra ortaya çıkar. Iki başlı solucanlar verim PZQ gövde parçası yenilenme Farmakolojik manipulasyon (Şekil 1B) aynı zamanda güçlü (EC 50 = 87 (+ -)% 11 bipolar parçaları, 48 saat 20 70μM PZQ). Iki kutupluluğun tek bir rejeneratif döngüsü boyunca ortaya çıkar. Bu testleri daha düşük etkinlik, büyük olasılıkla uyuşturucu çözünürlük ve / veya depolama, veya PZQ etkisiz bir farklı flatworm türlerin kullanımı ile ilgili sorunlar ile ilgilidir. Penetrasyonun daha düşük olan ilaçlar için, bir anteriorization indeksi genellikle tam iki kutupluluk 22 kenara ara fenotipleri puan için kullanılır. Pozitif kontrol yapıları RNAi fenotipleri Şekil 1'de gösterilmiştir: japonica Dugesia RNAi altı-1 (D j-six-1), gözsüz bir fenotip 23 (Şekil 1C), Dugesia japonica PC2 RNAi (Dj-PC2) sonuçları ışık kaçınma tepkisi 24 (Şekil 1D) ve RNAi kaybı sonuçları Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1), iki başlı bir gövde parçaları (Şekil 1E) fenotip 16-19, 21 sonuç . Bu fenotipleri aşağıdaki basit RNAi protokolleri kullanarak elde edilebilir: Dj-altı-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), F = besleme döngüsü ve x = rejeneratif döngüsü sırasıyla. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1:... Trunk parçası rejenerasyon tahlil Sol, planarian (üstte) ve şematik (orta) Image eksize gövde parçası yerini göstermek için sağ, gövde parçası yenilenme timecourse belirtilen zamanlarda yenileyici parçası görünümünü gösteren (gün) B PZQ maruz tarafından üretilen iki başlı planarian Image Dj-altı-1 RNAi. mobil kontrol solucan göre hareketsiz Dj-PC2 RNAi solucanlar (lekeli kırmızı) ışık kaçınma tepkisi D kaybı, (lekeli tarafından üretilen C 'gözsüz' solucan Dj-βcatenin-1 RNAi tarafından üretilen yeşil) E Bipolar planarian. BE, RNAi solucanlar orijinal anterior ucu sola yönelik. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2: D. birçok genin etkili olduğu demonte için birden fazla beslenmeleri oluşan tipik RNAi protokolü (F) ve rejeneratif döngüleri (x) için devir besleme ve kesim sırası japonica. Bireysel genler için bu protokol Modifikasyonu kullanarak, örneğin, en iyi sonuçlar için gerekli olabilecek daha az (parantez) veya besleme ve rejeneratif döngüleri daha büyük bir sayı.

<ol><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Entwm+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+patterns+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li>
<li>Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li>
<li>Newmark, P. A. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+needed+for+regeneration%2C+stem+cell+function%2C+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li>
<li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li>
<li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+the+central+nervous+system%3A+how+easy+for+planarians%21%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li>
<li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22A+Laboratory+Manual+Chapter%22%5BJournal%5D)">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li>
<li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians%3A+translations+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li>
<li>Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li>
<li>Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li>
<li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Hedgehog%2FPatched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li>
<li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li>
<li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2%2B+channel+beta+subunits%3A+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li>
<li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li>
<li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li>
<li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Djeyes+absent+%28Djeya%29+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li>
<li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+%28CNS%29+revealed+by+neuronal+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokolleri japonica planarian Dugesia yenilenme eğitim ve işlenmesi için burada ayrıntılı testlerin nitelendirdi. Bunlar basit ve kolayca laboratuar veya sınıf yapılabilir gibi özel ekipman gerektirmez. Tahliller ayrı ayrı ya da kombine (kimyasal ilaç etkinliklerinin in vivo genetik tarama için) ve aday gen düzeyinde yapılabilir, ya da tarafsız, daha yüksek verim tarama 8 adapte olabilir. Kendi sağ Planaryalar ilginç biyoloji eğitim için olsun, ya da doku rejenerasyonu çalışmak için alternatif bir model memeli homologları in vivo fonksiyonu değerlendirmek için, araştırmacılar bu yaklaşımların çeşitli faiz katalize edilmelidir .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Satıcı </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Kaynak suyu </td><td> Kandiyohi. Premium Waters A.Ş. Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> Kaynak suyu diğer formları da iyi çalışır. Canlılığı testlerin ilk deneme. </td></tr><tr><td> (1,6) NaCl, CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0.1mm), KCl (0.1mm), NaHCO3 (1.2mm), Hepes (1.5mm): 1 x Montjuich tuzları tamponlu. 24 pH 7.4 ° C. </td><td> Birden çok tedarikçiden </td><td> n / a </td><td> PH tampon sağlamak için rejeneratif deneyleri sırasında ilaç tedavileri için yapay su. 5 / 8 Holtfreter çözümü bir alternatiftir. </td></tr><tr><td> 2xYT Broth </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Medya = 31 g / L. Otoklavlı. </td></tr><tr><td> Petri Dish (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Yenilenme döngüleri sırasında Konut solucanlar </td></tr><tr><td> Kare Bulaşık (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11A </td><td> Solucan kesim yüzeyi buz tepsisi olarak kullanılan su, dondurma ile doldurun </td></tr><tr><td> Plastik küvet: Ziploc Büküm &#39;n Loc (16oz). </td><td> Çeşitli perakendeciler </td><td> n / a </td><td> RNAi kohortlarında için uygun su geçirmez kaplarda </td></tr><tr><td> Tavuk Karaciğer </td><td> Ticari bakkal </td><td> n / a </td><td> Antibiyotik kaçınma nedeniyle organik kaynakları önyargılı. </td></tr><tr><td> Blender </td><td> Herhangi bir mutfak tedarikçisi </td><td> n / a </td><td> Tavuk karaciğeri püresi yapmak için kullanın. </td></tr><tr><td> Tel 1mm Mesh süzgeç </td><td> Herhangi bir mutfak tedarikçisi </td><td> n / a </td><td> Tavuk karaciğeri püresi süzme için kullanın </td></tr><tr><td> Sığır kırmızı kan hücreleri </td><td> Lampire Biyolojik Laboratuvarları </td><td> 7240807 </td><td> % 100 eritrosit süspansiyonu Yıkanmış ve havuzlu </td></tr><tr><td> Dairesel filtre kağıtları </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Transferi Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Steril, cerrahi bıçaklar </td><td> Birden çok tedarikçiden </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4668 </td><td> 4 karanlıkta saklayın toz alikotları ° C Birbirinden ayrılacak. </td></tr><tr><td> Dj-altı-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> RNAi &quot;göz&quot; fenotip 23 için pozitif kontrol </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> Iki başlı fenotip 17 RNAi pozitif kontrol </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> RNAi, ışık kaçınma fenotip 24 kaybı için pozitif kontrol </td></tr></tbody></table>

farmakolojik ve fonksiyonel genetik tahliller planarian rejenerasyon işleyin<emjaponica> dugesia</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Serbest yaşayan planarian flatworms olağanüstü rejeneratif kabiliyetleri 1 deneysel kullanım nedeniyle uzun bir geçmişi var. Bu hayvanların eksize Küçük parçaları eksik vücut yapıları yenilenme orijinal vücut planı reformu. Örneğin, eğer sağlam bir solucan bir &#39;gövde&#39; parçası kesilir, yeni bir &#39;kafa&#39; anteriora yeniden ve &#39;kuyruk&#39; (Şekil amputasyon öncesindeki özgün vücut yapılarının &#39;baş-kuyruk&#39; kutupluluk geri posteriora yeniden 1A). Yenileme, &#39;normal vücut homeostazı ve uygulanan doku rejenerasyonu sırasında ~ 30 farklı hücre tipleri haline ayırt neoblasts&#39; olarak bilinen planarian kök hücreleri tarafından tahrik edilmektedir. Bu rejeneratif sürecinin sağlam ve göstermek için kolay. Şimdi birkaç öncü laboratuarları, birçok araç ve fonksiyonel genetik yöntemler bağlılığı sayesinde bu model sistemi için optimize edilmiştir. Sonuç olarak, önemli son gelişmeler planarian gelişimsel plastisite 2-9 temelini oluşturan moleküler olayları anlama ve manipüle yapılmıştır. Planarian model sistem bilim adamlarından oluşan geniş bir ilgi olacaktır. Sinirbilimciler için, model, bütün bir sinir sisteminin rejenerasyon çalışması yerine, sadece tek bir sinir hücresi süreci genellikle birçok kurulan modellerde çalışmanın odak regrowth / tamir için fırsat tanıyor. Planaryalar bir bolluk ifade nörotransmitterlerin (10), merkezi sinir sistemi 11, 12, evrim eğitimi için önemli bir sistem temsil ve davranış tarama potansiyeli 13, 14 . Rejeneratif sonuçlarını, farmakolojik ve genetik apparoaches tarafından manipülasyon için uygun. Örneğin, uyuşturucu, sadece gövde parçaları yerleştirerek amputasyon sonra uyuşturucu içeren farklı zaman noktalarında çözümler rejenerasyon üzerindeki etkileri için taranmalıdır. Mikroenjeksiyon, devir veya dsRNA yapıları 8, 9, 15, bakteriyel ifade beslenme yoluyla da elde edilebilir demonte yöntemleri (in vivo RNAi), bireysel genlerin rolü incelenebilir . Her iki yaklaşım, bipolar hayvanlar 16-21 yüksek penetrans-örneğin, rejenerasyon görsel olarak çarpıcı fenotipleri üretebilir . Bu model ve bu yöntemlerin uygulanması benimsenmesini kolaylaştırmak için, biz, planarian Dugesia japonica kullanarak, farmakolojik ve genetik testlerin (in vivo RNAi ile besleyerek) Bu video makale protokollerde vitrin.

, Canlı hayvan içinde kök hücre farklılaşması çalışmak için cazip bir model planarian flatworm. Yenileme, temel laboratuvar kolayca yapılır basit amputasyon deneyleri ile çalışılmış ve farmakolojik ve genetik (uygun<em&gt; In vivo</em&gt; RNAi) Bu makalede protokolleri tarafından ayrıntılı olarak manipülasyon.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Serbest yaşayan planarya yassı solucanları, dikkat çekici rejenerasyon yetenekleri nedeniyle uzun bir deneysel kullanım geçmişine sahiptir1. ...'dan çıkarılan küçük parçalar...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, Parian yassı solucanlarında farmakolojik ve/veya genetik knockdown yöntemlerini kullanarak rejenerasyon deneyleri gerçekleştirmek ve bunları manipüle etmektir. İlk adım, temel amputasyon ve rejenerasyon deneyinde uzmanlaşmaktır. Ardından, rejenerasyon polaritesini bozmak için ilaçların nasıl kullanılabileceği, örneğin, iki başlı hayvanlar elde etmek için nasıl uygulanacağı gösterilmektedir.Son olarak, besleme yoluyla in vivo RNAi'nin nasıl gerçekleştirileceğine dair bir açıklama sunulmaktadır. Bu işlem, belirli genlerin fonksiyon kaybının etkilerini incelemek amacıyla yapılır. Sonuçlar, quintal ilacı ile yapılan tedavinin rejenerasyonu bozarak iki başlı solucanlar oluşturduğunu ve betaine ile izoformun genetik nakavtının (knockdown) buna oldukça benzer bir fenotip ürettiğini göstermektedir.Merhaba, benim adım John Chan, marching laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim ve bu prosedürleri ben uygulamalı olarak göstereceğim. Bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi önemlidir çünkü tek başına hiçbir adım zor olmasa da, bu tekniklerin genel olarak gösterilmesi bu model sistemle yeni tanışan araştırmacılara yardımcı olacaktır.Analize hazırlık için, yaklaşık 30 parian'dan oluşan bir kohortun beslemesini, açlık sürecinden sonra en az beş gün boyunca durdurun. Solucanların analiz gününde boyu 8 ile 10 mm arasında olmalıdır. Önceden düzlenmiş bir buz kabını suyla durulayın ve düz buz yüzeyini pens yardımıyla streç filmle kaplayın.Plastik streç filmin üzerine bir adet filtre kağıdı yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak filtre kağıdını birkaç damla kaynak suyu ile nemlendirin ve filtre üzerine 20 adetten fazla solucan yerleştirmeyin. Gerekirse, solucanlar daha fazla kaynak suyu ile tekrar pipetleme yapılarak filtre üzerinde yeniden konumlandırılabilir.Solucanlar yerleştirildikten sonra, fazla sıvıyı bir skalpel kullanarak temizleyin; hayvanın anterior apeksi ile farinksin anterior ucu arasındaki mesafenin yaklaşık ortasından tek bir kesik yaparak baş kısmını ampute edin. Ardından, hayvanın kuyruk ucu ile farinksin posterior ucu arasındaki mesafenin yaklaşık ortasından tek bir kesik yaparak kuyruk bölgesini ampute edin. Kesim işleminden sonra skalpel üzerindeki fazla mukusu %70 ethanol ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yardımıyla temizleyin ve tekrar kesim yapmadan önce skalpel üzerindeki fazla ethanolü silin.Filtreyi pensetle alın ve kaynak suyu içeren bir Petri kabına aktarın. Yara kapanması için yaklaşık üç dakika bekleyin; bu durum, yaranın büzülmesi ve koyulaşmasıyla gözlemlenebilir. Filtre kağıdındaki gövde fragmanlarını, rejenerasyon deneyi için istenen besiyerini içeren bir Petri kabına yıkayarak aktarın ve 24 °C'ye ayarlanmış bir termostatlı inkübatöre yerleştirin.Yaklaşık bir hafta sonra rejeneratif fenotipi skorlayın. Rejenerasyona uğramış yapılar tanımlanabildiğinde, aynı gün taze olarak kullanmak üzere ilacı DMSO içinde çözerek 200 millimolar quintal veya PZ Q stok hazırlayın. Ardından, 22,5 microliter PZ Q stokunu tamponlanmış majic tuzlarına ekleyip yaklaşık bir dakika boyunca vorteksleyerek 50 milliliters ilaç içeren çözelti hazırlayın.Dispersiyonu sağlamak için solucanları yay kaynaklı su ile nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin ve gövde fragmantasyonu rejenerasyon testiyle tanımlandığı şekilde hem baş hem de kuyruk bölgesini ampute edin. Amputasyon ve yara kapanmasının ardından, gövde fragmanlarını yay kaynaklı su içeren bir Petri kabına aktarın. Ortamı 90 micromolar PZ Q çözeltisi ile değiştirin ve Petri kabını 24 degrees Celsius'lik inkübatöre yerleştirin. 24 ila 48 saat sonra, PZ Q içeren ortamı yay kaynaklı su ile değiştirerek solucanı birkaç kez yıkayın, solucanları inkübatöre geri koyun ve bir hafta sonra, test öncesinde solucanların bipolarite veya çift başlılık fenotipini skorlayın.Tavuk karaciğeri homojenatını hazırlayın, gıda stokundaki sarı renkli yağlı kısımları ayıklayın ve ardından kalan karaciğeri püre haline getirip bir süzgeçten geçirin. Saklama için aqua süspansiyonu hazırlayın. Ardından, sığır eritrositlerini veya RBC'leri, -20 °C'de saklanan 1 mL'lik örnekler halinde paylaştırarak hazırlayın.Beş gün boyunca aç bırakılmış solucanlar kullanın ve bunları üç kohorta ayırın. İlgi alanı olan gen, pozitif kontrol (RNAi fenotipi bilinen bir gen) ve negatif kontrol (RNAi fenotipi olmayan bir gen).Her kohort için, sekiz ila 10 milimetre uzunluğunda yaklaşık 250 solucan kullanın. Her kohort için, ilgili genleri hedefleyen çift zincirli RNA eksprese eden bir e coli stokunu, bir tüp tavuk karaciğer homogenatını ve bir tüp RBC'yi çözdürün. Bakterileri 13, 000 Gs'de santrifüj ederek çöktürün. Bir dakika boyunca süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 700 microliter iki XYT medyumu içinde yeniden süspande edin.Tekrar santrifüjleyin, süpernatanı dökün ve ardından peleti buza yerleştirin. Pipet ucunun ucunu keserek geniş ağızlı bir P 200 pipet ucu oluşturun; bakteriyel peleti, RNAi besleme karışımı oluşturmak için 150 µL tavuk karaciğer homogenatı ve 50 µL RBC içeren çözeltide tamamen yeniden süspande edin. Besleme öncesinde, kısa bir santrifüj darbesiyle hava kabarcıklarını giderin.Solucanların bulunduğu plastik küvetten, yaklaşık bir inç derinlik kalacak şekilde suyun büyük bir kısmını uzaklaştırın. Solucanları kabın merkezinde toplamak için küveti dairesel hareketlerle sallayın. Ardından, solucanları çevreleyerek RNAI besleme karışımını dairesel bir şekilde pipetle ekleyin.Yaklaşık bir saatlik beslemeden sonra, diğer beslenenlere rahatsızlık vermeden kaçanları transfer pipeti yardımıyla dikkatlice RNAi besleme karışımına geri yönlendirin, iyi beslenenleri belirleyin ve yeterince beslenmemiş görünen solucanları uzaklaştırın. İyi beslenmiş solucanlar, yutulan RBC'ler nedeniyle koyu kırmızı bir renk alır.Yemlerin yutulmasını önlemek amacıyla sarsıntıyı en aza indirerek, besleme çözeltisini dikkatlice taze kaynak suyuyla değiştirin. Bunu yapmak için, bir transfer borusu kullanarak solucanları nazikçe kabın bir yanına toplayın. Kirli suyu boşaltın ve taze suyu, kabın karşı duvarından aşağıya dökerek dikkatlice ekleyin; solucanların havaya uzun süre maruz kalmasını önlemek için onları hızla tekrar suya daldırın.Ayrıca gevşek bir şekilde besin alımıyla sonuçlanır. Kapak kapatılır ve solucanlar 24 degrees Celsius inkübatörüne geri yerleştirilir. RNAi fenotiplerini nihai olarak taramak için, rejenerasyon döngüleriyle aralıklı olarak çoklu döngüler boyunca bu RNAi besleme protokolünü tekrarlayın.Birçok gen için etkili olan standart bir besleme ve rejenerasyon programı burada gösterilmiştir. F, besleme protokolünü ve X rejenerasyon analizini temsil eder. Protokol toplamda yaklaşık bir ay sürer ve optimal protokolün mRNA stabilitesi, doku lokalizasyonu, protein, P dur veya rejenerasyon sonrası birden fazla besleme döngüsünü engelleyen bir fenotipin gelişimi gibi faktörlere bağlı olması nedeniyle, parantez içindeki F'lerle gösterilen daha az sayıda veya daha fazla besleme eklenerek farklı genlere göre modifiye edilebilir.Gövde rejenerasyon testi için tipik sonuçlar burada sunulmuştur. Solda, amputasyon kesimlerini gösteren bir şemanın üzerinde bir parian gösterilmiştir. Sağda ise, üçüncü güne kadar göz lekelerinin ortaya çıktığı, yedi gün boyunca gerçekleşen gövde parçası rejenerasyonunun zaman çizelgesi yer almaktadır.Burada, gövde fragmanı rejenerasyonunun PZ Q ile farmakolojik olarak engellenmesi ele alınmıştır. DJ 61 genine karşı RNAi uygulaması, iki başlı solucanlar ortaya çıkarmıştır. Bir FX FX besleme protokolü ilis fenotipiyle sonuçlanırken, bir FFFX besleme protokolü sonrası görülen ışık kaçınma yanıtının kaybı, mobil kontrol grubuna kıyasla kırmızıyla boyanmış immobil DJ PC iki RNAi solucanları ile sonuçlanmıştır. Birinde DJ beta catine'in RNAi ile susturulduğu solucanlar yeşile boyanmıştır.Bir FXFX besleme protokolünün kullanılması, posterior yaradan bir başın rejenerasyonu ile sonuçlanır. Bu prosedürleri takip eden araştırmacılar, parian biyolojisi ve doku rejenerasyonundaki rollerini incelemek amacıyla, knockdown yöntemleri veya seçici farmakolojik ajanlar kullanarak araştırmalarıyla ilgili hedef genleri belirleyebileceklerdir.

pharmacological-functional-genetic-assays-to-manipulate-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Planaria arasında tanımlanmış ve tutarlı bir büyüklükte doku aşılama için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Ayrıca nakli için kullanılan immobilizasyon tekniği canlı hayvanların kısmi ışınlanması için kurşun kalkanlar, ile birlikte, nasıl uyarlanabileceğini bir açıklama dahildir.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Caenorhabditis elegans antipsikotik ilaçlar (APDS) etkilerini test etmek için yaklaşımlar gösterilmektedir. Deneyler gelişimi ve canlılığı üzerinde ve yutak pompalama hızı üzerindeki, ilaç etkilerini test etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda APDS başka ilaç sınıfları ile farmakogenetik deneyler için geçerlidir.

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planer hareketliliği, hayvanların sadece kaynak suyundaki hareketi ile karşılaştırıldığında doğal ürünlerin uyarıcı ve geri çekilme özelliklerini ölçmek için kullanılır.

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

Tatlı su planarians üç yürüyüş sergiler (kayma, peristalsis, ve scrunching) kantitatif davranış analizi ile ayırt edilebilir. Çeşitli zararlı uyaranlar, bunların nicelliği ve peristalsis ve süzülme ayrımı kullanılarak scrunching'i tetikleyen bir yöntem tanımladık. Gen nakavtını kullanarak, kantitatif henotipik okuma olarak scrunching özgüllüğünü gösteririz.

Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching

Bu protokol, tatlı su planaryaları Schmidtea mediterranea'daki  yumurtalıkları incelemek için atılan adımları sunar.Diseke edilen yumurtalıklar, oositlerin ve somatik hücrelerin hücre biyolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu ile antikor immün boyama ve ultrastrüktürel analiz için uyumludur ve daha önce erişilemeyen bir görüntüleme derinliği ve kalitesi sağlar.

Ultrastrüktürel Analiz ve Antikor Boyama için Planaryan Over Diseksiyonu

Burada, bu hücreleri dopaminerjik öncü hücrelere farklılaştırarak, bunları Parkinson hastalığının fare modellerine naklederek ve nakledilen hücrelerin başarılı entegrasyonunu ve fonksiyonel etkinliğini doğrulamak için davranışsal ve elektrofizyolojik sonuçları değerlendirerek hassas nöronal modülasyon elde etmek için kimyasal olarak yeniden programlanmış kök hücrelerin mühendisliği için bir protokol açıklıyoruz.

Nörodejeneratif Hastalıkların Tedavisinde Yeniden Programlanmış Kök Hücre Kaynaklı Öncü Hücrelerde Kemogenetik Düzenleme

Öğrenin planarya solucanlarında rejenerasyon testleri yapmayı ve farmakolojik veya genetik yöntemlerle manipüle etmeyi. Bu teknikler kök hücre farklılaşması ve rejeneratif biyoloji araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin Dugesia

Daha fazla video keşfet