Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Bu prosedürün genel amacı, bir steroid reseptörü HSB 90 protein kompleksini biyokimyasal olarak yeniden oluşturmak ve steroid reseptörü ligand bağlanma aktivitesini yeniden aktive etmektir; bu işlem, HSB 90 kofaktör gereksinimlerini ve yeniden oluşturma sürecine ekzojen bileşikler eklenmesinin etkilerini test etmek için kullanılabilir. Bu işlem, öncelikle fonksiyonel glukokortikoid reseptörleri içeren hücre sitozolü hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, hücre sitozolündeki GR immün adsorpsiyonla ayrıştırılır ve endojen.

HSP 90 ayrıştırılır. Ardından, ekzojen bir HSP 90 kaynağı ile diğer şaperon proteinleri ve ko-faktörler kullanılarak GR HSP 90 hetero kompleksi yeniden oluşturulur. Son olarak, yeniden oluşturulan protein kompleksleri ve ligand bağlanma aktivitesi analiz edilir; GR HSP 90 hetero kompleks oluşumunu ve steroid bağlanma aktivitesini göstermek için özellikle SDS page, western blotting ve radyoaktif ligand bağlanma assayleri gibi yöntemler kullanılır.

Bu yöntem, HSP 90 fonksiyonel aktivitesini kolaylaştırmak için hangi kofaktör şaperonların ve COS şaperonlarının gerekli olduğu gibi, HSP 90 moleküler şaperon alanı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem protein katlanması hakkında bilgi sağlayabilse de, HSP 90 bağımlı öncü bileşiklerin geliştirilmesi ve HSP 90 gerektiren hücre içi sinyal yolaklarının analizi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan yeni mezun olan öğrenciler Hannah Franklin ve Nathan for AWA olacaktır. Fonksiyonel glukokortikoid reseptörü veya GR izole etmek için, rekombinant GR bao virüsü ile enfekte edilmiş ve eksponansiyel büyüme evresinde olan fare fibroblast L 9 29 hücrelerini veya SF nine hücrelerini büyütün. Hücre süspansiyonunu 4 °C'de, 5.000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin.

Elde edilen pelet yaklaşık bir ila beş mililitre hacminde olmalıdır. Hücre peletini 15 mililitre Hank's dengeli tuz çözeltisi ile üç kez yıkayın. HEM tamponu, bir millimolar phenyl methyl syl fluoride veya PMSF ve bir havan yardımıyla 50 kez ezilmiş üç adet complete mini proteaz inhibitör tableti içeren 1,5 hacim homogenizasyon tamponu hazırlayın.

Hücreler homojenizatör ile parçalandı; protein degradasyonunu önlemek için bu adım buz üzerinde gerçekleştirildi. Homojenat, bir ultrasentrifüj ile 4 °C'de 30 dakika boyunca 100,000 Gs'de santrifüj edildi. Sitozol içeren süpernatan, her biri 500 µL olacak şekilde 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırıldı ve -20 °C'de saklandı.

Reseptöre özgü GR'ye karşı geliştirilmiş monoklonal IgG antikoru içeren bir karışım hazırlamak için, çözünmüş GR içeren 100 microliters sitozolü, 200 microliters TEGM tamponunu, 100 microliters %20'lik protein A-sefaroz veya PAS bulamacını ve bugger two gibi 5 micrograms anti G monoklonal IgG antikorunu birleştirin. PAS boncuklarının nispeten büyük boyutu nedeniyle.

PAS'ı %20'lik süspansiyondan örnek tüplerine aktarmak için ucu kesilmiş bir P 200 pipet ucu kullanın. Örnekleri dikey dönen bir çarka yerleştirin ve sürekli rotasyonla minimum iki saat inkübe edin. Ardından, örnekleri soğutmalı bir santrifüjde bir dakika boyunca çevirerek antikor PAS peletindeki bağlanmamış proteinleri uzaklaştırın.

10,000 Gs'de, bir mililitre TEGM tamponu ekleyip vorteksleyerek ve ardından santrifüjleyerek peleti iki kez yıkayın. Endojen HSB 90'ı GR immüno peletinden ayırmak için son yıkama sıvısını kıstırılmış bir P 200 pipet ucuyla uzaklaştırın; ardından antikorla önceden hazırlanmış PAS peletine 355 mikrolitre TEG tamponu ve 45 mikrolitre beş molar sodyum klorür ekleyin.

Numuneleri dikey dönen bir tekerleğe yerleştirin ve sabit rotasyonla bir buçuk saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış proteinleri, 10,000 Gs'de bir dakika boyunca santrifüj ederek immün peletten uzaklaştırın. Peletleri bir kez 1 mL TEG tamponuyla ve bir kez 10 mM HEPES tamponu (pH 7.4) ile yıkayın. Peleti bozmamaya dikkat ederek, kilitli bir P 200 pipet ucu kullanarak yıkama solüsyonunu uzaklaştırın.

GR HSB 90 hetero kompleksini yeniden oluşturmak için, pelete tavşan retikülosit lizatı gibi bir moleküler şaperon kaynağı içeren 50 microliters karışım ve beş microliters AT P üreteç sistemi ekleyin. Bir sonraki bu adım, peletin ve yeniden oluşturma solüsyonunun yeterince karıştırılmasını sağlamak açısından kritiktir. Numuneleri tam olarak 20 dakika boyunca 30 degree Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda inkübe edin.

Peleti nazikçe dağıtmak ve yeniden çözme solüsyonunu karıştırmak için tüpleri her bir ila iki dakikada bir hafifçe sallayın. Bir mililitre TEGM tamponu ekleyin, vorteksleyin ve 10.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatantı uzaklaştırın.

Yeniden oluşturulan pellet içindeki proteinleri tanımlamak için yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Beta mercaptoethanol içeren 50 µL SDS page örnek tamponu ekleyerek elektroforez için örnekleri hazırlayın. Örnekleri karıştırın ve ardından kaynar su banyosunda veya 100 °C'lik bir elektronik ısıtma bloğunda beş dakika inkübe edin.

Numuneleri 10, 000 Gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bu numunelerden elde edilen süpernatantı, SDS page veya ardından western blot ile mikroakışkan elektroforez için kullanın. Süpernatantı yüklemek için P 200 tırtıklı uç kullanmak, pelletin yanlışlıkla aspire edilmesini engelleyecektir.

Bir sonraki adım, GR HSP 90 protein kompleksinin steroid bağlanma aktivitesini analiz etmektir. Trityele steroid kullanarak, yeniden oluşturulmuş immüno pelletine 47,5 µL HEM tamponu ve 2 µM trityele dekzametazonun 2,5 µL'sini ekleyerek başlayın.

Mikrosantrifüj tüpünün çeperine yapışan örnek miktarını minimumda tutmaya dikkat ederek pelletle nazikçe karıştırın. Örneği buz üzerinde,yeşil müdahale etmeden gece boyunca inkübe edin. Bir mililitre TEGM tamponu ekleyip nazikçe karıştırın ve 10, 000 GS hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Bağlanmamış tritiyumlu steroid içerir; TEGM tamponu ile toplam üç yıkama işlemini tamamen tekrarlayın. Son yıkamanın sonunda tüm süpernatantı uzaklaştırın.

Sıkıştırılmış bir P 200 pipet ucu kullanın. Yıkanmış immün pelletleri 200 µL TEGM tamponunda süspande edin ve 10 mL'lik sintilasyon tüplerine aktarın.

Şişelere 4,8 mililitre sintilasyon kokteyli ekleyin ve vorteksten geçirin. Son olarak, sıvı sintilasyon spektrometrisi gerçekleştirin; temsilci SDS page ve western blot verileri burada, bu kumasi boyamalı jelde gösterilmektedir. Endojen GR HSB 90 hetero kompleksi, anti GR antikorları kullanılarak hücre sitozolünden immünabsorbe edilmiş ve GR ile birlikte ko-absorbe edilen bireysel proteinler görselleştirilmiştir.

Burada, yeniden oluşturulmuş GR HSP 90 hetero komplekslerini temsil eden deneysel mikroakışkan elektroforez verileri yer almaktadır. GR immünoabsorpsiyonunun özgüllüğü, aşırı miktarlarda kullanılsa bile, immüno adsorbe eden anti-GR antikoru yerine non-immün bir antikoru koyarak doğrulanmıştır. Herhangi bir GR veya moleküler şaperon immünopresipite edilmemiştir.

Benzer şekilde, tuzla temizlenmiş GR'den HSP 90 ve diğer şaperon proteinlerinin ayrılması, temizlenmiş ve yeniden oluşturulmuş immün çökeleklerin western blot analizi ile doğrulanabilir. İmmün absorpsiyon antikorunun ağır zinciri hem Coomassie boyama hem de western blotting ile saptanabilmektedir ve bu durum, her şeritte eşit büyüklükte immün çökeleklerin görselleştirildiğini doğrulamaktadır. İmmün absorptif GR'nin temsili steroid bağlanma aktivite verileri, burada retikülosit lizatı veya saflaştırılmış proteinler kullanılarak sunulmuştur.

Yeniden oluşturulan GR HSP 90 hetero kompleksinin steroid bağlama aktivitesi, tipik olarak endojen GR HSP 90 bağlama aktivite seviyesinin %75 ile %100'üne geri döner. Elektroforez verilerine benzer şekilde, negatif kontrol olarak ve spesifik olmayan tritiyeli steroid bağlamasının bir ölçüsü olarak anti GR antikoru yerine non-immün bir antikor kullanılabilir. Bu prosedürün ardından, HSP 90 post-translasyonel modifikasyonların hetero kompleks yeniden oluşumu ve steroid bağlama üzerindeki etkisinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için 2D jel elektroforezi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Burada açıklananlar gibi yeniden oluşturma analizleri, araştırmacıların glukokortikoid reseptörünü model bir HSP 90 istemci proteini olarak kullanarak, HSP 90 HSP 70 tabanlı MultiPro şaperon mekanizmasının fonksiyonel önemini ve adım adım kurulumunu incelemelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, hücresel lizatlardaki saflaştırılmış proteinlerden fonksiyonel glukokortikoid reseptörü HSP 90 protein komplekslerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Kullanılan adımlar arasında GR içeren hücre lizatı reseptör immün absorpsiyonunun hazırlanması, endojen proteinlerin tuzla uzaklaştırılması (salt stripping) ve ekzojen HSP 90, HSP 70 kofaktörleri ve ko-şaperonlar kullanılarak hetero kompleksin yeniden oluşturulması yer almaktadır.