Name: Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Öğrenin, hidrofobik etkileşim kromatografisi ile protein saflaştırma için otomatik sütun seçimi yöntemini. Bu teknik, orta basınçlı sıvı kromatografi sistemi kullanarak rekombinant proteinlerin verimli ve tekrarlanabilir saflaştırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Sağlık hibe GM086822 ve Ulusal Bilim Vakfı başlıca araştırma enstrümantasyon hibe DBI-0.960.313 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Jon Miyake ve Donna Hardy (Bio-Rad) ve teknik uzmanlık için Jennifer Loertscher (Seattle). Kromatografisi reaktifler seçin ve tamamlayıcı enstrümantasyon cömertçe Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.

<ol><li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li>
<li>Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+modeling+of+nonlinear+hydrophobic+interaction+chromatographic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).</li>
<li>To, B. C., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins.+IV.+Protein+adsorption+capacity+and+transport+in+preparative+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).</li>
<li>Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+mild+hydrophobic+interaction+chromatography+for+%22method+scouting%22+protein+purification+strategies+in+aqueous+two-phase+systems%3A+a+study+using+model+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins.</a> Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).</li>
<li>Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+proteins+in+receptor+research%3A+an+emerging+tool+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).</li>
<li>Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.A+Protocol+for+the+Production+of+KLRG1+Tetramer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer.</a> J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+Magnetosome+Associated+Protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41.</a> J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automatic+system+for+multidimensional+integrated+protein+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).</li>
<li>Camper, D. V., Viola, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fully automated protein purification.</a> Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).</li>
<li>Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+green+fluorescent+protein+screen+for+identification+of+well-expressed+membrane+proteins+from+a+cohort+of+extremophilic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms.</a> Protein Sci. 18, 121-133 (2009).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).</li>
<li>Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins.</a> J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).</li>
<li>McCue, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+use+of+hydrophobic+interaction+chromatography+in+protein+purification+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications.</a> Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).</li>
</ol>

Kromatografisi reaktifler seçin ve tamamlayıcı enstrümantasyon Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.

Sıvı kromatografi teknikleri 7 biyokimyasal, immünolojik 6 yürütülmesi için gerekli olan yüksek derecede saflaştırılmış protein hazırlanması, ve yapısal 8 çalışmalar için çok değerli olduğu kanıtlanmıştır. HIC saflaştırma yöntemleri çoğunlukla tercih edilen ortamın ampirik belirlenmesi gerekir, ve ligand yapısı, ligand yoğunluğu, ve matris boncuk özellikleri her kromatografik sonuçlar 2, 3 etkisi gösterilmiştir. Izcilik Otomatik sütun sonraki optimizasyonu ve protein saflaştırma 4 için bir HIC orta seçilmesi için etkili bir yaklaşımdır. Sunulan otomatik sütun izcilik yöntemi kolaylıkla çeşitli HIC protein saflaştırma stratejileri adapte edilebilir. Tuz konsantrasyonu, tuz seçimi, tuz degrade ve pH değişiklikler ilave arıtma hastalıkları iyileştirebilir ve bu temel parametreleri değişen etkileri daha önce 13,14 gözden geçirilmiştir. Kısmen saflaştırılmış hedef prote içeren HIC eluatdaha da bu tür iyon değişimi kromatografisi (IEX) veya jel filtrasyonu / boyut harici kromatografi 9,10 olarak tamamlayıcı bir kromatografik tekniği kullanılarak saflaştırılabilir. Çünkü eşsiz ışık absorbans ve emisyon karakteristikleri, GFP ile elüsyon profiline-line ve post-çalıştırma yaklaşımlar kullanılarak belirlenebilir. Bu amaçla, bu protokol daha da alakasız bir hedef protein GFP &quot;tagged&quot; olduğu, rekombinant GFP-füzyon proteinlerinin saflaştırılması için adapte edilebilir. GFP-etiketli hedef proteinin UV ışığı 11 ve yukarıda açıklanan HIC saflaştırma stratejisini içeren çeşitli kromatografik yaklaşımlar kullanılarak saflaştırıldı ile tespit edilebilir. GFP arıtma aynı zamanda modern protein bilimi teknikleri 12 öğretimi için biyokimya laboratuvarlarında pedagojik bir elyaf haline gelmiştir. Temel HIC protein saflaştırılması bir ölçüde daha az sağlam kromatografisi sy kullanarak yürütülebilirkenKök, burada sunulan enstrümantasyon olumlu sonuçlar elde yardımcı olmak için farklı bir takım avantajları vardır. Son derece otomatik bir sistem kullanmanın önemli yararları çalıştırmak çalıştırılmaya koşulu tekrarlanabilirlik, zaman tasarrufu da geliştirilmiş ve sistem 10 içine verilmek üzere hava için fırsatlar azalma sayılabilir. Sistem arttıran kolaylaştırılır Sistemi kontrollü tampon karıştırma, tampon hazırlanması ve deneysel tekrarlanabilirlik artan tutarlılık sağlar. Tüm izcilik için dinamik örnek döngü içine yeterince örnek yük Çizim çalışan başka her sütun eklenmeden örnek uyum sağlar ve kesinti veya yeniden manuel olarak sıralı çalışmaları için izin verir. Sütun üzerine örnek loop kontrollü numune enjeksiyonu el ile örnek yükleme ile oluşabilir değişkenliği azalır. Sütun seçimi valf bir çift sistemi replumb gerek kalmadan, ardışık Örnek ishal, farklı bir HIC kolonu kullanılarak her biri için olanak sağlar. Mul Sahne<html> eşsiz bir spektrofotometrik profil ile bir protein test edilmesinden sonra ti-dalgaboyu analizi özellikle faydalı olmaktadır. GFP ek olarak, sitokromlar, flavoproteins, ve diğer heme ihtiva eden proteinler Bu tekniğin yararlanabilir. İletkenlik ve pH izleme cihazları gerçek zamanlı deneysel koşullar doğrulanması için izin verir. Bölünmüş fraksiyonu eluat toplama geliştirilmiş fraksiyonu bir şekilde kullanılmasını sağlar ve minimal bir örnek hacmi (örneğin ELISA, SDS-PAGE, western blot ve Experion mikroakışkan elektroforezi) gerektiren post-run analiz yöntemleri için kolay aktarım sağlar. Ikinci fraksiyon toplayıcı çevrimdışı kullanma kılavuzu senkronizasyon gerektirir iken, fraksiyon toplayıcı seçimi maksimum esneklik sağlar. HIC izcilik sütun ve protein saflaştırma için böyle sağlam bir kromatografi sistemi kullanan için en önemli sakıncaları başlangıç ​​zamanı ve aracı satın alma ve operatör eğitimi ile ilgili bütçe harcamaları içerir. t &quot;&gt; Burada sunulan protokolü Bio-Rad Çift Geçişli kromatografi sistemi kullanır;. Ancak, bu tür GE Healthcare gelen Akta Avant diğer üreticilerin, eşit derecede sağlam enstrümantasyon da olabilir kullanıldığı ve eşdeğer sonuçlar üretmektedir bile karşılaştırılabilir kromatografi sistemi bir arınma prosedürü veya cihaz satın başlamadan önce düşünülmelidir benzersiz özellikleri (örneğin yöntemi programlama, bileşen adlandırma, operatör tercihi ve ölçeklenebilirlik sınırlamalar) var.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">Biyolojik Çift Geçişli Pathfinder 20 Sistemi</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Sistemi arttırıcı, mikser, F10 iş istasyonu, AVR7-3 valf, QuadTec UV / akış hücresi, BioFrac fraksiyon toplayıcı, biyolojik yazılımı ile Vis dedektör ve başlangıç ​​kiti içerir </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8 akışı seçin valf</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> Biyolojik Çift Geçişli sistemi ile kullanım için yüksek basınç vana, 9-port, 8-konumunda, 3500 psi (233 bar) sınırı, </td></tr><tr><td> Yönlendirici vana SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Biyolojik Çift Geçişli sistemi ile kullanım için selenoid vana, 3 yollu, 2 konumlu, 30 psi (2 bar) sınırı, </td></tr><tr><td> Akış ayrıştırıcı vana </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tical = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kiti </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Örnek döngü kiti Sürme-piston, döngü sürgülü 25 ml DynaLoop, DynaLoop parça kiti (# 750-0450) içerir </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFrac Kesir Collector</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> İki fraksiyon col<html> lectors kullanılan </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac mikroplak damla kafa adaptörü</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac mikrotitre plakası adaptörü</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = ABD &amp; lang = tr &amp; ProductID = 741-0017 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV Optik Modülü</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Halojen lamba</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> Bir target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Gradient Pompası</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> düşük basınçlı protein saflaştırılması için gradient pompa, boru ve bağlantı parçaları kiti içerir </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion Sistemi</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = 224301 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7.007.001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 Analiz Kiti</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap HIC sütun seçimi kiti </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Izcilik için HIC medyanın 7 x 1 ml kullanıma hazır sütunlar içerir </td></tr><tr><td> GE Healthcare-to-Bio-Rad sütun parçaları </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 ve 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

protein saflaştırma kullanım için otomatik hidrofobik etkileşim kromatografisi sütun seçimi

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Temizleyici proteinleri (örneğin, jel filtrasyonu, afinite, ve iyon değişimi) için diğer kromatografik metodlar aksine, hidrofobik etkileşim kromatografısi (HIC) yaygın olarak en uygun kromatografik orta seçmek için deneysel tayini (tarama ya da &quot;izcilik&quot; olarak anılacaktır) gerektirir Verilen bir proteinin saflaştırılması için 1. Burada anlatılan yöntem proteinin saflaştırılması kullanılmak üzere en uygun HIC ortam için izcilik için otomatik bir yaklaşımı tarif eder. HIC hidrofobiklik farklılıklara bağlı olarak bir ham lizat proteinleri ve diğer biyomoleküllerin ayırır. Afinite kromatografisi (AC) ve iyon değişimi kromatografisi (IEX) benzer şekilde, bu HIC kromatografi işlemi boyunca ilerlerken ilgili proteini konsantre yeteneğine sahiptir. Iyi HIC tarafından arıtma için uygundur Proteinler hidrofobik yüzey bölgeler ve 2 M cephane aşan konsantrasyonlarda tuz maruz dayanabilmesi olanlar dahilNeodinyum sülfat ((NH4) 2 SO4). HIC genellikle bir yakınlık etiketi eksik proteinler için bir arınma yöntemi olarak seçilmiş, ve AC için böylece uygun ve IEX yeterli arıtma sağlamak için başarısız olduğunda edilir. Proteininin yüzeyde hidrofobik yarımlar geçici bir inert, hareketsiz matris şekilde bağlanmış bir polar olmayan ligant bağlama. Protein ve ligand arasındaki etkileşimi protein-ligand etkileşimi güçlendirmek ve hareketsiz protein (yani sütun içindeki bağlı) 2 yaparak yüksek iyonik konsantrasyonları, kromatografi sütunu akan tampon tuz konsantrasyonu son derece bağımlıdırlar. Tuz konsantrasyonu düşüş olarak, protein-ligand etkileşimi dağıtır, protein tekrar sütundan mobil ve elutes hale gelir. Çeşitli HIC ortam önceden paketlenmiş kolon, ticari olarak mevcuttur, birkaç hidrofobik ligandları (örn. oktil S-butil, butil, ve fenil) her birinin içeren bir spec agaroz boncukları üzere yoğunlukları değişen çapraz-bağlantılıIFIC çapı 3. Izcilik Otomatik sütun HIC medyanın geleceği, daha ayrıntılı bir optimizasyon denemeleri için istihdam ve protein saflaştırma 4 çalışır gereken belirlemek için etkin bir yaklaşım getirmektedir. Burada saflaştırılmış olan özel protein rekombinant yeşil flöresanlı protein (GFP) &#39;dir, ancak bir yaklaşım, bir veya daha fazla hidrofobik yüzey bölgeleri ile diğer proteinleri saflaştırılması için adapte edilmiş olabilir. GFP UV ışığı 5 maruz kaldığında kendi istikrar, 397 nm&#39;de benzersiz ışık absorbansı tepe, ve floresan nedeniyle yararlı bir model protein olarak hizmet vermektedir. Wild tip GFP içeren bakteri lisatı, yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan bir Bio-Rad Çift Geçişli orta basınçlı sıvı kromatografisi sisteme yüklenir ve farklı bir ortam ihtiva HIC HiTrap HIC kolonlara adsorbe edildi. Protein kolonlardan elüt ve in-line ve post-çalıştırma tespit yöntemleri ile analiz edildi. Tampon karıştırma, dinamik örnek döngü enjeksiyon, sıralı colUMN seçimi, çoklu dalga boyu analizi, ve iki fraksiyon eluat toplama deneysel yaklaşımın sistemi ve çoğaltılabilirlik işlevselliği artmıştır.

Proteinin saflaştırılması işleminde kullanılmak üzere uygun hidrofobik etkileşim kromatografısi (HIC) ortam tanımlanması için otomatik bir yöntem sunulmaktadır. Otomatik bir yöntem tampon karışım, dinamik bir örnek enjeksiyon döngüsü, ardışık sütun seçimi, çoklu dalga boyu analizi, ve iki fraksiyon eluat toplama dahil olmak üzere, orta basınçlı sıvı kromatografisi sistemi kullanır.

Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi

Proteinleri saflaştırmak için kullanılan diğer kromatografik yöntemlerin (ör. jel filtrasyonu, afinite ve iyon değişimi) aksine, hidrofobik etkileşim...

Bu prosedürün genel amacı, BioRad DUO flow orta basınçlı sıvı kromatografisi sistemi kullanarak rekombinant bir proteinin saflaştırılması için otomatik bir tarama yöntemi aracılığıyla optimal bir HI sıvı kromatografisi kolonu seçmektir. Bu işlem, öncelikle gerekli tamponların ve ilgilenilen rekombinant proteini içeren bakteriyel lizatların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, duo flow kromatografisi sistemi fiziksel olarak kurulur, borulama işlemleri yapılır ve tarama protokolü için hazırlanır.Ardından numuneler yüklenir ve fraksiyon numune EIT'sini toplamak için programlanmış HI kolon tarama yöntemi çalıştırılır. Son olarak, EIT analiz edilir ve gözlemlenen ayırma özelliklerine dayanarak optimal HI kolonu ve medyası belirlenir. Nihayetinde, DUO flow otomatik HI kolon tarama yetenekleri kullanılarak, orta basınçlı sıvı kromatografisi yoluyla araştırmacının ilgilendiği proteinin ölçekli saflaştırması için tercih edilen bir HI kolon medyasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, manuel kolon kromatografisinin ardışık tekrarları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, işlemin otomatikleştirilmesinin değişkenliği azaltması ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, modern sıvı kromatografisi sistemlerinin fiziksel karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ancak, bu durum kolaylıkla öğrenilebilir.Yeterli pratikten sonra, prosedürü laboratuvarımdan iki öğrenci olan Orange Stone ve Shelly Anderson gerçekleştirecek. Başlamak için şu tampon çözeltilerin 500 mililitresini hazırlayın: tampon A1 için 200 milimolar sodyum fosfat, tampon A2 için 200 milimolar sodyum hidrojen fosfat ve tampon B2 için 4,8 molar amonyum sülfat. Deiyonize su, tampon B1 olarak görev yapacaktır; optimal kromatografik çalışma koşullarını sağlamak için tamponların gazını alın. Sistem maksimize edicisi, düşük tuzlu bir fosfat elüsyon tamponu oluşturmak için tampon A1 ve A2'yi, yüksek tuzlu amonyum sülfat oluşturmak için ise tampon B1 ve B2'yi karıştıracaktır.Başlangıç tamponu. Saflaştırılacak proteini içeren 10 mililitre hücre lizatı ile 10 mililitre tampon B ikisini karıştırarak, yüklenecek 20 mililitrelik numuneyi hazırlayın. Hücre lizatı numune çözeltisinin nihai amonyum sülfat konsantrasyonu yaklaşık 2,4 molar olmalı ve böylece başlangıç tamponuna kabaca eşdeğer hale gelmelidir.Çözeltideki partikül maddeleri uzaklaştırmak için lizat tampon karışımını, düşük protein bağlama kapasiteli 0,45 mikrometre boyutunda bir şırınga filtresinden süzün. Numuneyi, sisteme yüklemeye hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kromatografi sisteminin fiziksel kurulumu ve tesisatı, bu prosedürün en karmaşık yönlerinden biridir.Duo akış kromatografi sistemini burada gösterilen diyagrama göre kurun. Tüm protokol boyunca yeterli miktarda tampon çözelti bulunduğundan ve boruların batık kalmaya devam edeceğinden emin olun. Numune yükleme valfini ve dinamik numune döngüsünü burada gösterildiği gibi bağlayın; numune döngüsünü, üçüncü konumdaki numune valfi girişine bağlayın.1/16 inç dış çaplı peak borusundan aynı boyutta sekiz çift hazırlayın. Ardından bu çiftleri, iki kolon seçim valfinin bir ile sekiz arasındaki konumlarına bağlayın. UV detektör lambalarını açıp tüm detektörlerin kalibre edildiğini onayladıktan sonra, fraksiyon toplayıcının akış ayırıcı valfini ve ayırıcı kontrolcüsünü burada gösterildiği gibi takın.İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcı ayırıcı valf ve ayırıcı kontrolörü, kromatografi iş istasyonundan bağımsız olarak çalıştırılır. Ayırma yüzdesini %10 olarak ayarlayın. İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcıdaki standart fraksiyon toplayıcı damlatma başlığını bir mikroplaka damlatma başlığı ile değiştirin.Örnek döngüsünü durulayın ve kromatografi sistemini yıkayın. Ardından, sistemden dakika başına bir mililitre hızında manuel bir elüsyon tamponu akışı başlatın. Bir mililitrelik yüksek kapasiteli tuzak HI kolonlarını, kolon seçim valflerinin iki ila sekiz numaralı konumlarına bağlayın.İkinci konum kolon seçim valflerini birbirine bağlayan birleşimi çıkarın. Akış yönünün yukarısındaki kolon bağlantılarını duo akışa takın. Tüm hava dışarı atılana ve büyük bir tampon damlası oluşana kadar elüsyon tamponunu bağlantılardan geçirin.Ardından, kolon girişine bağlı tıpayı çıkarın ve kolonun üzerine büyük bir damla düşük tuzlu tampon çözelti yerleştirin. Daha sonra kolonu akış yönündeki (upstream) bağlantı parçalarına takın. Çıkışı ise akış sonrası (downstream) kolon bağlantı parçalarına ve seçim valfi tüplerine bağlayın.Geri basınç limitini 40 PSI olarak ayarlayın. Kolonu, dakikada bir mililitre akış hızında beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile yıkayın. Kolonu, dakikada bir mililitre akış hızında 10 kolon hacmi başlangıç tamponu ile yıkayın.pH UV izleri ve geri basınç stabilize olduğunda, kolon seçim valflerini manuel olarak birinci konuma getirin ve tampon akışını durdurun. Numune yüklemek için, numune giriş tüpünü 20 mililitrelik numunenin içine daldırın. Ardından, numune döngü yükleme yıkama valfini birinci konuma ve numune yükleme valfini temizleme (purge) konumuna getirin.Örnek döngü yükleme pompasını çalıştırarak, örnek örnek yükleme valfine ulaştıktan hemen sonrasına kadar dakikada bir mililitre akış hızıyla pompa tüpüne çekin. Örnek yükleme valfini temizleme (purge) konumundan yükleme (load) konumuna getirin. Biyolojik yazılımındaki kurulum penceresinden, dinamik örnek döngüsüne 10 mililitre örnek çekilene kadar örnek döngü yükleme pompasını dakikada bir mililitre akış hızıyla yeniden başlatın.Bu tablodaki yıldızla işaretlenmiş sistem cihazlarını seçin. Ardından, programı denemek için altı adet HIC kolonu seçin. Doğrusal azalan tuz gradyanı ve altı kolonluk ön araştırma yöntemi, başlangıç tamponu akışını dakikada bir mililitre hızla manuel olarak başlatır.Program metod çalışmasını başlattıktan hemen sonra %90'dan %10'a EIT akış ayırmasını başlatmak için ayırıcı kontrolöründeki başlat düğmesine basın; ardından çevrimdışı 96 kuyucuklu plaka fraksiyon toplayıcısının ekran üzerindeki kontrol panelinden başlat düğmesine basın. Beklenen çalışma parametrelerini onaylamak için gerçek zamanlı ekranı gözlemleyin. Farklı HI ortamlarının ön incelemesi sırasında göreli ayrılmayı ve saflaştırmayı tahmin etmek için GFP'ye özgü 397 nanometre absorbans izini, genel protein 280 nanometre absorbans izi ile karşılaştırın. 96 kuyucuklu plaka fraksiyonlarından 5 ile 50 microliters arasındaki alikotlar yeni bir plakaya aktarılabilir ve ELISA veya Western blot ile spesifik protein içeriği, SDS page veya bir Experian mikroakışkan elektroforez sistemi ile toplam protein içeriği açısından analiz edilebilir. Ön inceleme çalışmalarına ait temsili tuz gradyanı iletkenliği ve kolon basıncı burada gösterilmiştir.Yüksek tuzlu tampon hatlarından çekilen tampon yüzdesi ile ölçülen tuz konsantrasyonundaki değişim, HI metodolojisi için tipiktir. Tuz konsantrasyonu azaldıkça, kolona bağlı proteinler elüe olur; gözlemlenen iletkenliğe karşılık gelen tuz konsantrasyonu, quad tech ve UV detektörlerini hemen takip eden hatta ölçülür. Tuz gradyenti ile iletkenlik izleri arasındaki sapma, tamponun tampon girişinden sistem boyunca geçip iletkenlik monitörüne ulaşması için gereken süreyi belirtir.Numune çalışması boyunca sistem basıncı ve pH nispeten sabit kalır. Bu şekil, toplam proteinin hat içi tespitine yönelik ardışık HI kolon ön keşif çalışmalarının kromatogramlarını göstermektedir. NGFP, sırasıyla 280 nanometre ve 397 nanometre dalga boyundaki ışık absorbansının ölçülmesiyle gerçekleştirilir.Her bir ön tarama çalışması için bağıl GFP bolluğu ve ayrımı yaklaşık olarak belirlenebilir. Bu şekildeki iki hattın karşılaştırılmasıyla, rezene FF ön tarama çalışmasının 10, 12, 14, 16 ve 18 numaralı fraksiyonlarına ait kültür tüpleri; karakteristik GFP emisyon spektrumunu gözlemlemek amacıyla ortam veya floresan oda ışığı ile ultraviyole ışık tüpleri altında hem karşıdan hem de yukarıdan görüntülenmiş olup GFP, 14 numaralı fraksiyonda net bir şekilde saptanmıştır. Her iki UV görüntüsünde, soldaki UV panelindeki yaygın mavi renk, UV lambasından yayılan ışıktır.Çalışma sonrası elde edilen bu veriler, elüat absorbansının 397 nanometrede ölçülmesiyle yapılan hat içi GFP tespitiyle iyi bir uyum göstermektedir; bu ölçüm aynı zamanda 14. fraksiyonun, elüye edilen GFP'nin ana pikiyle ilişkili olduğunu belirlemektedir. Bu prosedürün ardından, saflaştırılan proteinin saflığı ve fonksiyonel aktivitesiyle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla western blotting, ELISA, atomik kuvvet mikroskopisi ve biyokimyasal yeniden yapılandırma deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu prosedürü uygularken, yöntemin çeşitli noktalarında çift akış sisteminin manuel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Örnekler arasında tampon çözeltinin yeniden doldurulması ve numune yüklenmesi, hava kabarcıklarının kontrol edilmesi ve gerektiğinde deteksiyon lambalarının açılıp kapatılması yer alır. Bu videoyu izledikten sonra, optimal HI kolonları ve medyaları için otomatik ön tarama yapmak amacıyla bir sıvı kromatografi sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Satır içi ve poster analizle değerlendirme, araştırmacının sonraki ölçek büyütme saflaştırması için uygun bir kolon seçmesine olanak tanır; bu işlem, hedef protein saflığını ve verimini artırmak için diğer kromatografik yöntemlerle de birleştirilebilir.

automated-hydrophobic-interaction-chromatography-column-selection-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir Escherichia coli kültüründen alınan proteinin net yüzey yüküne dayalı olarak insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 saflaştırmak için bir anyon değişim kromatografisi tekniği gösteriyoruz.

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

Bu videoda, kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi yoluyla diyalize edilmiş bir hücre lizatından kalsiyum bağlayıcı proteinin saflaştırılmasını gösteriyoruz. Kalsiyum bağlayıcı proteinler, kalsiyum ile bağlandıktan sonra hidrofobik bir bölge açığa çıkarır ve reçine üzerindeki hidrofobik bir grupla etkileşimi kolaylaştırır. Daha sonra bu proteinler, etkileşimi tersine çeviren kalsiyum şelatör EDTA kullanılarak ayrıştırılır.

Kalsiyum Bağımlı Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi: Hidrofobik Etkileşimlere Dayalı Kalsiyum Bağlayıcı Proteinleri Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu video, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi kullanılarak hidrofilik polar bileşiklerin ayrılması ilkesini göstermektedir. Bu teknik, N-glikanlar dahil olmak üzere çeşitli polar analitlerin saflaştırılmasına yardımcı olur.

Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofilik Polar Analitleri Hidrofilik Boncuklar Kullanarak Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu video, antikor-ilaç konjugatlarının hidrofobik etkileşim sıvı kromatografisi tabanlı karakterizasyonunu göstermektedir. Bütil ligand bazlı bir kromatografi kolonu kullanılarak, antikor-ilaç konjugatları, ligand ile hidrofobik etkileşimler yoluyla karakterize edilir.

Bütil Bağımlı Hidrofobik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofobik Etkileşimlere Dayalı Antikor-İlaç Konjugatlarını Karakterize Etmek İçin Bir Teknik

Bu video, afinite sıvı kromatografisi kullanılarak histidin etiketli kendi kendine monte edilmiş protein nanopartiküllerinin veya SAPS'lerin saflaştırılmasını gösterir. Elde edilen saflaştırılmış SAPN fraksiyonları, aşı geliştirme için uygundur ve potansiyel immünoterapötik uygulamalar için umut vaat etmektedir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak Kendi Kendine Birleşen Protein Nanopartiküllerinin Saflaştırılması

Fumarilasetoasetik hidrolaz etki alanı içeren proteinlerin ifade ve arıtma örnekleri ( E. coli, FPLC ifadesi) ile açıklanmıştır. Arıtılmış proteinler kristalizasyon ve antikor üretimi için kullanılır ve enzim asdında istihdam edilir. Seçilen fotometrik asdalar, oxaloasetat dekarboksilaz ve acylpyruvate hydrolase olarak FAHD1 Multi-functionality görüntülemek için sunulmaktadır.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41)...

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Öğrenin, hidrofobik etkileşim kromatografisi ile protein saflaştırma için otomatik sütun seçimi yöntemini. Bu teknik, orta basınçlı sıvı kromatografi sistemi kullanarak rekombinant proteinlerin verimli ve tekrarlanabilir saflaştırılmasını sağlar.

Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi

Daha fazla video keşfet