Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi

Bu prosedürün genel amacı, bir BioRad DUO akış ortamı basınçlı sıvı kromatografi sistemi ile rekombinant bir proteinin saflaştırılması için otomatik bir keşif yöntemi kullanarak optimal bir HI sıvı kromatografi kolonunu seçmektir. Bu, önce ilgilenilen rekombinant proteini içeren gerekli tamponların ve bakteri lizatlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, ikili akış kromatografi sistemi fiziksel olarak kurulur, tesisatı yapılır ve keşif protokolü için hazırlanır.

Daha sonra numuneler yüklenir ve fraksiyon numunesi eit'sini toplamak için programlanan HI sütunu keşif yöntemi çalıştırılır. Son olarak, EIT analiz edilir ve gözlemlenen ayırma özelliklerine dayalı olarak en uygun hi sütunu ve ortamı belirlenir. Sonuç olarak, DUO akışı otomatik HI kolon keşif yetenekleri kullanılarak orta basınçlı sıvı kromatografisi yoluyla araştırmacının ilgilendiği proteinin ölçeklendirilmiş saflaştırılması için tercih edilen bir HI kolon ortamını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, manuel kolon kromatografisinin sıralı çalışmaları gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, işlemin otomatikleştirilmesinin değişkenliği azaltması ve yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, modern sıvı kromatografi sistemlerinin fiziksel karmaşıklığı nedeniyle mücadele edebilir. Ancak, bu kolayca ustalaşabilir.

Yeterli uygulamanın ardından prosedürü gösteren Orange Stone ve Shelly Anderson, laboratuvarımdan iki öğrenci olacak Başlamak için aşağıdaki tamponlardan 500 mililitre, tampon için 200 milimolar sodyum fosfat, tampon A için bir 200 milimolar sodyum hidrojen fosfat ve 4.8 molar amonyum sülfat hazırlayın. Tampon B için, iki deiyonize su tampon B görevi görecek, biri optimum kromatografik çalışma koşullarını sağlamak için tamponların gazını alacaktır. Sistem maksimize edici, düşük tuzlu bir fosfat elüsyon tamponu oluşturmak için A bir ve A iki tamponlarını bir araya getirecek ve yüksek tuzlu amonyum sülfat oluşturmak için B bir ve B iki tamponlarını karıştıracaktır.

Arabelleği başlatın. Saflaştırılacak proteini içeren 10 mililitre hücre lizatını 10 mililitre B iki tamponu ile karıştırarak yüklenecek 20 mililitre numune hazırlayın. Hücre lizat numune çözeltisinin nihai amonyum sülfat konsantrasyonu yaklaşık 2.4 molar olmalıdır, bu da onu kabaca başlangıç tamponuna eşdeğer hale getirir.

Partikül maddeyi çözeltiden uzaklaştırmak için lizat tampon karışımını düşük protein bağlayıcı 0.45 mikrometre şırınga filtresinden süzün. Numuneyi sisteme yüklenmeye hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kromatografi sisteminin fiziksel kurulumu ve tesisatı, bu prosedürün en karmaşık yönlerinden biridir.

İkili akış kromatografi sistemini burada gösterilen şemaya göre kurun. Tüm protokol için yeterli miktarda tamponun mevcut olduğundan ve borunun su altında kalmaya devam edeceğinden emin olun. Numune yükleme valfini ve dinamik s'yi takınampburada gösterildiği gibi döngü, s'yi s'ye bağlayınample s'ye sampüçüncü konumdaki valf girişi.

16. inç dış çaplı bir tepe borusundan aynı boyutta sekiz çift hazırlayın. Ardından çiftleri iki kolon seçim valfinin bir ila sekizinci konumlarına bağlayın. UV dedektör lambalarını yaktıktan ve tüm dedektörlerin kalibre edildiğini onayladıktan sonra, fraksiyon toplayıcının akış ayırıcı valfini ve ayırıcı kontrolörünü resimde gösterildiği gibi takın. Burada.

Konum iki fraksiyonlu kolektör ayırıcı valf ve ayırıcı kontrolör, kromatografi iş istasyonundan çevrimdışı olarak çalıştırılır. Yüzde bölmeyi 10 olarak ayarlayın. İki fraksiyon toplayıcı konumundaki standart fraksiyon toplayıcı damla kafasını bir mikroplaka damla kafası ile değiştirin.

Numune döngüsünü durulayın ve kromatografi sistemini yıkayın. Ardından, sistemde dakikada bir mililitrelik manuel bir evrim tamponu akışı başlatın. Bir mililitre yüksekliğindeki tuzak HI kolonlarını, kolon seçim valflerinin iki ila sekizinci konumlarına bağlayın.

Konumu iki kolon seçim vanasına bağlayan rakoru çıkarın. Yukarı akış kolon bağlantı parçalarını ikili akışa takın. Elucian tamponunu, tüm hava dışarı atılana ve büyük bir tampon damlası mevcut olana kadar bağlantı parçalarından geçirin.

Ardından, sütun girişine bağlı durdurucuyu çıkarın ve sütunun üstüne büyük bir damla düşük tuz tamponu yerleştirin. Ardından kolonu yukarı akış bağlantı parçalarına takın. Çıkışı aşağı akış kolon bağlantılarına ve seçim valfi borularına takın.

Geri basınç sınırını 40 PS'ye ayarlayın. Sütunu beş sütun hacmiyle yıkarım. Dakikada bir mililitre akış hızında evrim tamponu. Kolonu dakikada bir mililitre akış hızında 10 kolon hacmi başlatma tamponu ile yıkayın.

pH, UV izlemeleri ve karşı basınç stabilize olduktan sonra, kolon seçim valflerini manuel olarak bir konuma getirin ve tampon akışını durdurun. Bir numune yüklemek için, numune giriş borusunu 20 mililitrelik numuneye daldırın. Ardından, numune döngüsü yük yıkama valfini bir konuma ve boşaltmak için numune yükleme valfini değiştirin.

Numune yükleme valfine ulaştıktan hemen sonraya kadar numuneyi dakikada bir mililitrelik bir akış hızında pompa borusuna çekerek numune döngü yükleme pompasının hareketini başlatın. Numune yükleme valfini tahliyeden yüke geçirin. Biyolojik yazılımdaki kurulum penceresinden, dinamik numune döngüsüne 10 mililitre numune çekilene kadar numune döngüsü yükleme pompasını dakikada bir mililitre akış hızında yeniden başlatın.

Bu tabloda yıldızla işaretlenmiş sistem aygıtlarını seçin. Ardından, programı analiz etmek için altı HIC sütunu seçin. Doğrusal bir azalan tuz gradyanı ve altı sütunlu bir keşif yöntemi, başlangıç tamponu akışını dakikada bir mililitre ile manuel olarak başlatır.

Program yöntemini başlattıktan hemen sonra %90 ila %10 EIT akış bölmesini başlatmak için ayırıcı kontrol cihazında başlat'a basın, yöntemi çalıştırın, çevrimdışı 96 kuyulu plaka fraksiyonu toplayıcısının ekran kontrol panelinde başlat'a basın. Beklenen çalışma parametrelerini doğrulamak için gerçek zamanlı ekranı gözlemleyin. GFP'ye özgü 397 nanometre absorbans izlemesini genel protein 280 nanometre absorbans izlemesiyle karşılaştırın, keşfedilen farklı HI ortamını kullanarak nispi ayırma ve saflaştırmayı tahmin etmek için, 96 kuyucuklu plaka fraksiyonlarından beş ila 50 mikrolitrelik alikotlar, taze bir plakaya aktarılabilir ve Eliza veya Western blot ile spesifik protein içeriği ve SDS sayfası veya bir Experian mikroakışkan elektroforez sistemi temsili hick tuzu kullanılarak toplam protein içeriği için tahlil edilebilir Keşif çalışmalarının gradyan iletkenliği ve kolon basıncı burada gösterilmiştir.

Yüksek tuz tampon hatlarından çekilen tampon yüzdesi ile ölçülen tuz konsantrasyonundaki değişim, HI metodolojisinin tipik bir örneğidir. Tuz konsantrasyonu azaldıkça, gözlenen kolon elüte iletkenliğine bağlı proteinler, tuz konsantrasyonu dörtlü teknoloji ve UV dedektörlerini takip eden çizgide ölçülür. Tuz gradyanı ve iletkenlik izlemeleri arasındaki uzaklık, tamponun tampon girişinden sistemden ve iletkenlik monitörüne gitmesi için gereken süreyi gösterir.

Numune çalışması boyunca sistem basıncı ve pH nispeten sabit kalır. Bu şekil, sıralı HI kolon keşfinin kromatogramlarını, toplam proteinin satır içi tespitini çalıştırır. NGFP, sırasıyla 280 nanometre ve 397 nanometrede ışığın emilmesinin ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Her keşif çalışması için göreceli GFP bolluğunu ve ayrımını yaklaşık olarak tahmin etmek mümkündür. Bu şekildeki iki çizginin fraksiyonlar için kültür tüpleri, rezene FF keşif çalışmasının 10, 12, 14, 16 ve 18'i ortam veya floresan oda ışığı altında görselleştirildi ve ultraviyole ışık tüpleri, karakteristik GFP emisyon spektrumunu gözlemlemek için hem yüzleri öne hem de yukarıdan aşağıya bakıldı, GFP fraksiyon 14'te açıkça tespit edildi. Her iki UV görüntüsünde de, sol UV panelindeki dağınık mavi, UV lambasından yayılan ışıktır.

Bu çalışma sonrası veriler, 397 nanometrede eluid absorbansını ölçerek GFP'nin satır içi tespitine güzel bir şekilde karşılık gelir ve bu aynı zamanda fraksiyon 14'ü ima edilen GFP'nin ana zirvesini içeren olarak tanımlar. Bu prosedürü takiben. Saflaştırılan proteinin saflığı ve fonksiyonel aktivitesi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için western blotlama, Eliza, atomik kuvvet mikroskobu ve biyokimyasal sulandırma testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, yöntemin birkaç noktasında çift akış sisteminin manuel olarak kontrol edilmesi ihtiyacını hatırlamak önemlidir. Örnekler arasında tamponun yeniden doldurulması ve numune yüklenmesi, hava kabarcıklarının kontrol edilmesi ve gerektiğinde algılama lambalarının açılıp kapatılması yer alır. Bu videoyu izledikten sonra, optimum HI sütunları ve ortamı için otomatik keşif yapmak üzere bir sıvı kromatografi sisteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Değerlendirilen bir analiz olan satır içi ve poster, bir araştırmacının, hedef protein saflığını ve verimini artırmak için diğer kromatografik yöntemlerle de birleştirilebilen, sonraki ölçek büyütme saflaştırması için uygun bir sütun seçmesine izin verecektir.