Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi

Bu prosedürün genel amacı, BioRad DUO flow orta basınçlı sıvı kromatografi sistemi kullanarak, rekombinant bir proteinin saflaştırılması için otomatik bir tarama yöntemiyle optimal bir HI sıvı kromatografi kolonu seçmektir. Bu işlem, öncelikle gerekli tamponların ve ilgili rekombinant proteini içeren bakteriyel lizatların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, duo flow kromatografi sistemi fiziksel olarak kurulur, boru bağlantıları yapılır ve tarama protokolü için hazırlanır.

Ardından numuneler yüklenir ve fraksiyon numune EIT'lerini toplamak için programlanmış HI kolon tarama yöntemi çalıştırılır. Son olarak EIT analiz edilir ve gözlemlenen ayırma özelliklerine dayanarak optimal HI kolonu ve medyası belirlenir. Nihayetinde, DUO flow otomatik HI kolon tarama yetenekleri kullanılarak orta basınçlı sıvı kromatografisi aracılığıyla, araştırmacının ilgilendiği proteinin ölçeklendirilmiş saflaştırılması için tercih edilen HI kolon medyasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin manuel kolon kromatografisinin ardışık tekrarları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sürecin otomatikleştirilmesinin değişkenliği azaltması ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, modern sıvı kromatografi sistemlerinin fiziksel karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ancak, bu durum kısa sürede kolaylıkla kavranabilir.

Yeterli pratik yaptıktan sonra, prosedürü laboratuvarımdan iki öğrenci olan Orange Stone ve Shelly Anderson gerçekleştirecektir. Başlangıç için şu tampon çözeltilerin 500 mililitresini hazırlayın: Tampon A1 için 200 milimolar sodyum fosfat, tampon A2 için 200 milimolar sodyum hidrojen fosfat ve tampon B2 için 4,8 molar amonyum sülfat. Tampon B1 olarak deiyonize su kullanılacaktır; optimal kromatografik çalışma koşullarını sağlamak için tamponların gazını alın. Sistem maksimize edicisi, düşük tuzlu fosfat elüsyon tamponu oluşturmak için tampon A1 ve A2'yi; yüksek tuzlu amonyum sülfat oluşturmak için ise tampon B1 ve B2'yi birleştirecektir.

Başlangıç tamponu. Protein saflaştırılacak hücre lizatı ile 10 mililitre tampon B twosu karıştırarak, yüklenecek 20 mililitrelik örneği hazırlayın. Hücre lizatı örnek çözeltisinin nihai amonyum sülfat konsantrasyonu yaklaşık 2,4 molar olmalı, böylece başlangıç tamponuna kabaca eşit hale getirilmelidir.

Çözeltideki partikülleri uzaklaştırmak için lizat tampon karışımını, düşük protein bağlama kapasiteli 0,45 mikrometre boyutunda bir şırınga filtresinden süzün. Numuneyi, sisteme yüklenmeye hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kromatografi sisteminin fiziksel kurulumu ve tesisatı, bu prosedürün en karmaşık yönlerinden biridir.

Çift akışlı kromatografi sistemini buradaki diyagrama göre kurun. Tüm protokol boyunca yeterli tampon hacminin mevcut olduğundan ve tüplerin daldırılmış halde kalmaya devam edeceğinden emin olun. Numune yükleme valfini ve dinamik numune loop'unu burada gösterildiği gibi bağlayın, numune loop'unu üçüncü konumdaki numune valfi girişine bağlayın.

1/16 inç dış çaplı PEEK tüpten aynı boyutlarda sekiz çift hazırlayın. Ardından, bu çiftleri iki kolon seçim valfinin bir ile sekiz arasındaki konumlarına bağlayın. UV dedektör lambalarını açıp tüm dedektörlerin kalibre edildiğini onayladıktan sonra, fraksiyon toplayıcının akış ayırıcı valfini ve ayırıcı kontrol ünitesini burada gösterildiği gibi takın.

İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcı ayırıcı valf ve ayırıcı kontrolörü, kromatografi iş istasyonundan bağımsız olarak çalıştırılır. Bölme yüzdesini %10'a ayarlayın. İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcı üzerindeki standart fraksiyon toplayıcı damlatma başlığını, mikroplaka damlatma başlığı ile değiştirin.

Örnek döngüsünü durulayın ve kromatografi sistemini yıkayın. Ardından, sistem üzerinden manuel olarak dakikada bir mililitre hızında elüsyon tamponu akışını başlatın. Bir mililitrelik yüksek tutucu HI kolonlarını, kolon seçim valflerinin iki ile sekiz arasındaki konumlarına bağlayın.

İkinci konumdaki kolon seçim valflerini birbirine bağlayan birleşimi çıkarın. Kolonun yukarı akış tarafındaki bağlantı parçalarını duo flow'a takın. Tüm hava tahliye edilene ve büyük bir tampon damlası oluşana kadar elüüsyon tamponunu bağlantı parçalarından geçirin.

Ardından, kolon girişine bağlı olan tıpayı çıkarın ve kolonun üst kısmına büyük bir damla düşük tuzlu tampon çözelti yerleştirin. Daha sonra kolonu üst akış bağlantı parçalarına takın. Çıkışı, alt akış kolon bağlantı parçalarına ve seçim valfi tüpüne bağlayın.

Geri basınç limitini 40 PSI olarak ayarlayın. Kolonu, dakikada 1 ml akış hızında beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile yıkayın. Ardından kolonu, dakikada 1 ml akış hızında 10 kolon hacmi başlangıç tamponu ile yıkayın.

pH, UV izleri ve geri basınç stabilize olduktan sonra, kolon seçim valflerini manuel olarak birinci konuma getirin ve tampon akışını durdurun. Numune yüklemek için, numune giriş tüpünü 20 milliliter numuneye daldırın. Ardından, numune döngüsü yükleme yıkama valfini birinci konuma ve numune yükleme valfini tahliye konumuna getirin.

Numune döngü yükleme pompasını çalıştırarak, numune yükleme valfine ulaşana kadar numuneyi dakika başına bir mililitre akış hızında pompa tüpüne çekin. Numune yükleme valfini purga konumundan yükleme konumuna getirin. Biyolojik yazılımın kurulum penceresinden, dinamik numune döngüsüne 10 mililitre numune çekilene kadar numune döngü yükleme pompasını dakika başına bir mililitre akış hızında yeniden başlatın.

Bu tablodaki yıldızla işaretlenmiş sistem cihazlarını seçin. Ardından, programı test etmek için altı HIC kolonu seçin. Doğrusal azalan tuz gradyanı ve altı kolonlu ön inceleme yöntemi, başlangıç tamponu akışını dakikada bir mililitre hızında manuel olarak başlatır.

90% ile 10% arasındaki EIT akış ayırmasını başlatmak için ayırıcı kontrolcüsündeki start düğmesine basın; program yöntem çalışmasını başlattıktan hemen sonra, çevrimdışı 96 kuyucuklu plaka fraksiyon toplayıcının ekran kontrol panelindeki start düğmesine basın. Beklenen çalışma parametrelerini onaylamak için gerçek zamanlı ekranı gözlemleyin. Farklı HI ortamlarının ön incelemesi sırasında göreceli ayırmayı ve saflaştırmayı tahmin etmek için GFP'ye özgü 397 nanometre absorbans izini, genel protein 280 nanometre absorbans izi ile karşılaştırın. 96 kuyucuklu plaka fraksiyonlarından 5 ila 50 µL'lik alikotlar yeni bir plakaya aktarılabilir ve ELISA veya Western blot ile spesifik protein içeriği, SDS-PAGE veya bir Experian mikroakışkan elektroforez sistemi ile toplam protein içeriği analiz edilebilir. Ön inceleme çalışmalarına ait temsili tuz gradyanı iletkenliği ve kolon basıncı burada gösterilmiştir.

Yüksek tuz konsantrasyonlu tampon hatlarından çekilen tamponun yüzdesi ile ölçülen tuz konsantrasyonundaki değişim, HI metodolojisinin tipik bir özelliğidir. Tuz konsantrasyonu azaldıkça, kolona bağlı proteinler elüye olur; gözlemlenen iletkenliğe karşılık gelen tuz konsantrasyonu, quad tech ve UV dedektörlerini takiben hemen hat üzerinde ölçülür. Tuz gradyanı ile iletkenlik izleri arasındaki fark, tamponun tampon girişinden sistem boyunca ilerleyerek iletkenlik monitörüne ulaşması için gereken süreyi gösterir.

Numune çalışması boyunca sistem basıncı ve pH nispeten sabit kalır. Bu şekil, toplam proteinin hat içi tespitiyle gerçekleştirilen ardışık HI kolon keşif çalışmalarının kromatogramlarını göstermektedir. NGFP, sırasıyla 280 nanometre ve 397 nanometredeki ışık absorbansının ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Her bir ön tarama çalışması için göreceli GFP bolluğu ve ayrımı yaklaşık olarak belirlenebilir. Bu şekildeki iki hattın karşılaştırılmasıyla, rezene FF ön tarama çalışmasının 10, 12, 14, 16 ve 18. fraksiyonlarına ait kültür tüpleri, karakteristik GFP emisyon spektrumunu gözlemlemek amacıyla hem ortam veya floresan oda ışığı hem de ultraviyole ışık tüpleri altında, hem karşıdan hem de üstten görüntülendiğinde, GFP'nin 14. fraksiyonda açıkça saptandığı görülmektedir. Her iki UV görüntüsünde, sol UV panelindeki yaygın mavi renk, UV lambasından yayılan ışıktır.

Çalışma sonrası elde edilen bu veriler, elüat absorbansının 397 nanometrede ölçülmesiyle yapılan GFP'nin hat içi (inline) tespitiyle iyi bir uyum göstermektedir; bu ölçüm aynı zamanda fraksiyon 14'ün, elüye edilen GFP'nin ana piki olduğunu belirlemektedir. Bu prosedürün ardından, saflaştırılan proteinin saflığı ve fonksiyonel aktivitesiyle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla western blotting, ELISA, atomik kuvvet mikroskopisi ve biyokimyasal rekonstitüsyon analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu prosedürü uygularken, yöntemin çeşitli noktalarında çift akış sisteminin manuel kontrolüne ihtiyaç duyulduğunu unutmamak önemlidir. Tampon çözeltinin yeniden doldurulması ve numune yüklenmesi, hava kabarcıklarının kontrol edilmesi ve gerektiğinde dedektör lambalarının açılıp kapatılması buna örnek gösterilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, optimal HI kolonları ve ortamları için otomatik ön tarama yapmak amacıyla bir sıvı kromatografi sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Satır içi analiz ve poster analizleri, araştırmacının sonraki ölçek büyütme saflaştırması için uygun bir kolon seçmesine olanak tanır; bu işlem, hedef protein saflığını ve verimini artırmak için diğer kromatografik yöntemlerle de birleştirilebilir.