Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Mikroglia - beyinde yerleşik makrofajlar - bir hücre yüzeyi integrini olan CD11b'yi eksprese eder.

Mikroglia'yı fare yavrusu beyinlerinden izole etmek için, papain, bir proteolitik enzim ve deoksiribonükleaz ile tampon içeren ayrışma tüplerinde beyin parçaları alın.

Tüpleri mekanik bir ayrıştırıcı üzerine yerleştirin. Çalışma sırasında, ayrışıcı dokuyu mekanik olarak bozar.

Papain, dokunun hücre dışı matrisini sindirir ve mikroglia da dahil olmak üzere hücreleri süspansiyona bırakır. Deoksiribonükleaz, süspansiyondaki serbest DNA'yı parçalayarak verimsiz hücre izolasyonunu önler.

merkezkaç. Pipetleme ile mekanik ayrışmayı tamamlayın. Kalıntıları ve hücre kümelerini çıkarmak için süspansiyonu bir hücre süzgecinden geçirin ve homojen bir tek hücre popülasyonu elde edin.

Anti-CD11b antikorları ile işlevselleştirilmiş süperparamanyetik mikro boncuklarla inkübe edin. Mikro boncuklar, mikroglia da dahil olmak üzere hücreler üzerindeki CD11b'ye spesifik olarak bağlanır.

Kuluçka sonrası, santrifüj. Bağlanmamış boncuklar içeren süpernatanı çıkarın. Tampondaki hücreleri yeniden askıya alın. Manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirilmiş bir sütuna yükleyin. Sütun, ferromanyetik boncuklu bir matris içerir.

Ayırıcı üzerine yerleştirildiğinde, sütun içindeki küreler manyetik alanı yükseltir ve diğer hücreler akarken mikro boncuk bağlı CD11b + hücrelerini sütun içinde tutar.

Ayırıcıdan çıkarın ve CD11b+ hücrelerini sütundan çıkarmak için arabellek kullanın. Süspansiyonu santrifüjleyin ve CD11b + hücrelerini bir mikroglia ortamında yeniden süspanse edin.

İzole edilen hücreler daha fazla analiz için hazırdır.

Bu tabloya göre ayrışma karışımını hazırlayın. 12 beyin parçasını, ayrışma tüpü başına toplam ağırlığı 1.2 gram olacak şekilde bir C-tüpüne aktarın. Ardından, C-tüplerini ısıtmalı ayrıştırıcıya yerleştirin. Ayrıştırıcıda en iyi duruma getirilmiş NTDK programını başlatın. 20 saniye santrifüjleyin. Üç kez pipetleyerek mekanik ayrışmayı tamamlayın.

Hücreleri, ekli süzgeçlerle birlikte dört adet 15 mililitrelik tüpe aktarın. Süzgeçleri kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mililitre HBSS ile durulayın. 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 10 mililitrelik bir pipetle çıkarın. Dikkatlice, kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mililitre HBSS ekleyin ve peleti tekrar süspanse edin. Yine, süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Peleti 6 mililitre ayırma tamponu ile tekrar askıya alın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. Daha sonra, 200 mikrolitre CD11b-mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve tüpleri 4 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, peleti 6 mililitre ayırma tamponu ile tekrar süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve peleti 8 mililitre ayırma tamponu ile yeniden süspanse edin.

Ardından, sekiz sütun hazırlamak için ayırıcı üzerindeki POSSEL programını izleyin. Bir seferde 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri sütundan geçirin. 1 mililitre ayırma tamponu ile CD11b pozitif hücreleri steril bir elüsyon plakası üzerinde elüte edin. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Peleti 10 mililitre soğuk mikroglia ortamı ile santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. CD11b pozitif hücreleri sayın. Mililitre başına 650.000 ila 700.000 hücre nihai konsantrasyonunu elde etmek için hücreleri soğuk mikroglia ortamında yeniden süspanse edin.