Bir Murin Modelinde Enfeksiyon Bölgesinde Nötrofil Alım Dinamiklerinin ve Bakteri Yükünün İzlenmesi

Nötrofillerin alımını izlemek için - bakteri klirensini kolaylaştıran temel bağışıklık hücreleri, sırtındaki bağ dokusunu açığa çıkaran bir yara ile anestezi uygulanmış, transgenik, bağışıklığı baskılanmış bir fare ile başlayın.

Transgenik farenin nötrofilleri, nötrofil takibini kolaylaştıran gelişmiş bir yeşil floresan proteini ifade eder. Ek olarak, bozulmuş bakteri öldürme yetenekleri, fareyi enfeksiyona karşı daha duyarlı hale getirir.

Biyolüminesans - ışık yayma özelliklerine sahip genetik olarak değiştirilmiş bir bakteri aşılayıcısı alın.

Bakteri aşısını yaralı bölgeye enjekte edin, bağ dokusu ile bağ dokusunun altındaki fibröz bir doku tabakası olan fasya arasında iletilmesini sağlayın. Enjeksiyon bölgesinde bakteriler çoğalır ve kolonize olarak doku enfeksiyonuna neden olur.

Enfeksiyona yanıt olarak, bağışıklık hücreleri nötrofilleri çeken kimyasal sinyal molekülleri olan kemokinleri serbest bırakır. Nötrofiller, kimyasal kaynaklı hareket olan kemotaksis yoluyla hızla göç eder ve kan damarlarından bakteriyel enfeksiyonun yakınındaki dokuya ekstravazat yapar.

Fareyi, sırasıyla bakteri yükünü ve işe alınan nötrofilleri temsil eden biyolüminesans ve floresan sinyalleri için görüntüleyin.

Zamanla, biyolüminesans ve floresan sinyallerindeki bir artış, enfeksiyon bölgesinde artan bakteri yükü ve sürekli nötrofil alımı ile ilişkilidir.

Staph aureus aşılaması için, 28 gauge insülin şırıngasını hazırlanan biyolüminesan bakteri aşılayıcısından 50 mikrolitre ile doldurun ve yaralı hayvanın dermisini yana çekmek için bir parmağınızı kullanın. Şırıngayı dokuya neredeyse paralel tutarak, dirençte ani bir azalma hissedilene kadar şırıngayı yavaşça dokuya sokun, bu da fasyanın delindiğini gösterir.

İğne yaranın ortasına yerleştirildiğinde, aşılayıcının tüm hacmini yavaşça verin. Aşılayıcının yaranın merkezinde minimum sızıntı veya dağılma ile bir kabarcık oluşturduğunu onaylayın ve şırıngayı hayvandan yavaşça çıkarın. Ardından, tamamen iyileşene kadar hayvanı ısı ve izleme ile kafesine geri koyun.

Yaralama ve enfeksiyondan sonra ve deney sırasında günlük olarak, anestezi uygulanmış fareyi, yara mümkün olduğunca düz olacak şekilde biyolüminesan ve floresan bir görüntüleyiciye yerleştirin. Görüntüleyici yazılımında, görüntüleme modları olarak Lüminesans ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi, küçük gruplamada 1 dakika, Lüminesans için F/stop 1, Fotoğraf için F/stop 8 ve Emisyon filtresi için Açık olarak ayarlanmalıdır. Ardından, görüntüyü kaydetmek için Satın Al'ı tıklayın.

İn vivo floresan görüntüleme için, görüntüleme modları olarak Floresan ve Fotoğraf'ı seçin. Pozlama süresi, küçük gruplamada 1 saniye, Floresan için F/stop 1, Fotoğraf için F/stop 8 ve yüksek lamba yoğunluğu ile sırasıyla 30 nanometre üzerinde 465 ve 20 nanometre üzerinde 520 Uyarma ve Emisyon dalga boylarına önceden ayarlanmalıdır. Ardından, görüntüyü kaydetmek için Satın Al'ı tıklayın.

Her iki görüntü setini de elde ettikten sonra, hayvanı tamamen iyileşene kadar izleyerek kafesine geri koyun.

Görüntü analizi için, ölçülecek görüntüyü uygun bir görüntü analizi yazılım programında açın ve varsayılan dairesel ilgi alanını, çevredeki cilt de dahil olmak üzere tüm yara alanına yerleştirin. İlgilenilen Bölgeyi Ölç'e tıklayın ve her sinyalin ortalama akısının zamana karşı çizilmesine izin vermek için yara için ortalama akı değerlerini kaydedin.

Yara iyileşmesini ölçmek için, yara kenarına dairesel bir ilgi alanı yerleştirin ve başlangıçtan zamana karşı fraksiyonel değişimin çizilmesine izin vermek için yaranın alanını santimetre kare olarak ölçün.