Güçlü TCR Sinyallerine Timosit Yanıtını Modüle Eden Kinaz İnhibitörlerinin Belirlenmesi

Çok oyuklu bir plakada fareler timosit hücreleri ile başlayın. Anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar ekleyin. Kuyucukların bir alt kümesine, test kinaz inhibitörünün uygun bir konsantrasyonunu ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Antikorlar, çift pozitif timositler üzerindeki hücre yüzeyi CD3 ve CD28 reseptörlerine bağlanır ve bunları aktive ederek T hücresi reseptörlerinin, TCR'lerin aşağı regülasyonuna ve sitozolik protein kinazın aktivasyonuna neden olur.

Bu protein kinazlar, aşağı akış sinyal yollarını aktive ederek hücre yüzeyi CD69 ekspresyonunun artmasına ve sitozolik kaspaz-3 aktivasyonuna yol açar. Aktive edilmiş kaspaz-3, temel hücresel proteinleri parçalar - timosit apoptozunu başlatır.

Kinaz inhibitörü ile tedavi edilen hücrelerde, inhibitörler sitozolik kinazları bloke ederek CD69 ekspresyonunu ve kaspaz-3 aktivasyonunu modüle eder.

Timositlerin TCR, CD4 ve CD8 ko-reseptörlerine ve CD69 reseptörlerine bağlanan florofor etiketli bir antikor kokteylinde pipetleyin. Timositleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için bir tampon ile muamele edin.

Sitozolik kaspaz-3'e bağlanan florofor etiketli bir anti-kaspaz-3 antikoru ile inkübe edin. Akış sitometrisi kullanarak timositleri analiz edin.

Kontrol çift pozitif timositler, floresan hücre yüzeyi belirteçleri CD4, CD8 ve CD69 ve hücre içi kaspaz-3'ü eksprese eder ve TCR aşağı regülasyonunu gösterir. Buna karşılık, inhibitör ile tedavi edilen timositler daha düşük floresan CD69 ve kaspaz-3 seviyeleri sergiler.

Timositlerin kinaz inhibitörleri ile tedavisine başlamak için, küçük hacimli bir plakaya timosit oyuğu başına 40 mikrolitre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı buzun üzerine koyun. Daha sonra, kinaz inhibitörlerinin, DMSO'nun ve deksametazonun bir kısmını ve tam RPMI ortamının dört kısmını 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin.

mikromolar konsantrasyonda seyreltilmiş deksametazon ekleyerek küçük hacimli plakanın sekiz kuyusunu işlenmemiş kontrollere, dört kuyucuğu hücre ölümü için deksametazon ile muamele edilen pozitif kontrollere ve dört kuyucuğu 0.5 mikrolitre seyreltilmiş DMSO ekleyerek araçla tedavi edilen kontrollere belirleyin. Daha sonra, inhibitör plakasının karşılık gelen oyuklarından, 96 oyuklu plakaya her seyreltilmiş inhibitörden 0.5 mikrolitre ekleyin.

Timositlerin stimülasyonuna başlamak için önce anti-CD3 ve CD28 boncuklarının düzgün bir şekilde yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Daha sonra, 1 mililitre boncukları 2 mililitre PBS tamponu ile yıkayın. Boncukları süpernatanttan ayırmak için tüpü manyetik bir standa koyun ve çözeltiyi aspire edin. Ardından, boncukları tam RPMI ortamının 1 mililitresinde yeniden süspanse edin.

İnhibitör ile muamele edilen her bir numuneye, DMSO ile muamele edilen dört numuneye ve 8 işlenmemiş numuneden dördüne boncuk süspansiyonunun oyuğu başına 10 mikrolitre ekleyin. Kalan dört işlenmemiş kuyucuğa 10 mikrolitre tam RPMI ekleyin.

Plakayı nazikçe çalkalamak için bir mikroplaka orbital çalkalayıcı kullanın. Daha sonra, timositleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ortamında 17 ila 20 saat veya gece boyunca inkübe edin.

Önce 150 mililitre etanol-Tween çözeltisi, ardından %1 Tween-20 ile takviye edilmiş deiyonize su ve son olarak FACS yıkama tamponu ile otomatik bir laminer akış plakası yıkayıcısını astarlayın. İnkübasyonun sonunda, plaka yıkama sistemini kullanarak, plakayı dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak FACS yıkama tamponu ile yıkayın. Her yıkama, laminer akışla 55 mikrolitre yıkama tamponu ekler ve çıkarır, bu da kuyucuklardaki reaktiflerin üstel seyreltilmesine neden olur.

Yüzey antijenlerini boyamak için, önce bir birim hacim anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 ve anti-CD69 antikorlarını 100 birim hacim FACS yıkama tamponunda seyreltin. Daha sonra, hücreleri 25 mikrolitre boyama antikor karışımında yeniden süspanse edin. Plakayı nazikçe çalkalamak için bir mikroplaka orbital çalkalayıcı kullanın ve ardından plakayı 30 dakika buz üzerinde bırakın.

Hücreleri sabitlemek için, önce plakayı daha önce tarif edildiği gibi dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak 55 mikrolitre FACS yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından, her bir kuyucuğa 50 mikrolitre sabitleme ve geçirgenlik tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, sağlanan 10x stoğun 25 mililitresini 225 mililitre ultra saf su ile seyrelterek 1x perma/yıkama tamponu hazırlayın.

Plaka yıkayıcıyı 1x tampon ile astarlayın ve plakayı daha önce açıklandığı gibi dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak 55 mikrolitre 1x tamponla yıkayın. 1 mililitre anti-kaspaz-3 antikoru ile 2 mililitre 1x perma karıştırın ve tamponu yıkayın. Sabit hücrelere karışımın oyuğu başına 25 mikrolitre ekleyin.

Plakayı nazikçe çalkalamak için bir mikroplaka orbital çalkalayıcı kullanın. Plakayı bir saat buz üzerinde bırakın. İnkübasyonun sonunda, 1x perma ve yıkama tamponu ile yıkama adımını dokuz kez tekrarlayın. Ardından, plakanın tüm kuyucuklarına 25 mikrolitre FACS yıkama tamponu ekleyin, çözeltiyi karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Son olarak, karışık numuneleri mikrotitre tüplerine aktarın. Tüpleri FACS yıkama tamponu ile toplam 200 mikrolitre hacme kadar doldurun ve akış sitometrisi analizine devam edin.