Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Patojen maruziyetini takiben, makrofajlar aktivasyona uğrar ve bağışıklık sistemi tepkisini koordine ederek pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler salgılar.

Kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonunu in vitro olarak incelemek için, izole edilmiş bir fare kemik iliği hücre süspansiyonunu bir kültür şişesine aktarın. Kısaca kuluçkaya yatırın.

Mezenkimal hücreler, monositler ve olgun makrofajlar şişe yüzeyine yapışırken, hematopoietik progenitörler süspansiyonda kalır.

Hematopoetik progenitörler ve santrifüj içeren ortamı toplayın. Makrofaj koloni uyarıcı faktör, M-CSF ortamında yeniden süspanse edilen hücreleri bir kültür şişesine aktarın.

M-CSF, miyeloid progenitör alt popülasyonunun, dallanmış görünen ve şişeye yapışan makrofajlara farklılaşmasına neden olur.

Yapışık olmayan hücre içeren ortamı atın. M-CSF ortamı ekleyin ve inkübe edin. Makrofajlar tamamen işlevsel durumlarına ulaştıklarında, onları hasat edin. Merkezkaç.

Plaka makrofajları, M-CSF ortamında çok kuyulu plaka kuyularına yeniden süspanse edilir. Kuyucuklara makrofaj yapışmasını takiben, insan poliklonal immünoglobulinleri ve bir toksin olan bakteriyel lipopolisakkarit, LPS ekleyin.

İmmünoglobulinler spesifik FCγ reseptörlerine bağlanırken, LPS makrofajlar üzerindeki Toll benzeri reseptörlere bağlanır. Bu ko-stimülasyon, aşağı akış sinyal kaskadları yoluyla anti-inflamatuar makrofaj aktivasyonunu yönlendirir ve yüksek seviyelerde anti-inflamatuar sitokinlerin ve düşük seviyelerde pro-inflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur.

Makrofaj aktivasyonunu doğrulamak için daha fazla analiz için sitokin içeren ortamı toplayın.

Ötenazi yapılmış bir fareyi uzuvları uzanmış bir köpük tahta üzerine sırtüstü yatırın, ardından bacakları% 70 etanol ile temizleyin. Ardından, her bir arka bacağın yüzeyinden deriyi ve kürkü çıkarmak için yaklaşık 2 milimetre derinliğinde sığ bir kesim yapın. Ardından, tibia ve femurlara erişmek için dokuları inceleyin.

Tibiaları ve uyluk kemiğini çıkarmak için, kalça ekleminin hemen altındaki ve ayak bileklerinin üzerindeki kemik ve kasları kesin. Ardından, kas dokusunun mümkün olduğunca çoğunu kemiklerden çıkarın. Daha sonra, kemikleri% 70 etanol ile temizleyin ve 1 dakika buharlaşmasına izin verin, ardından kemikleri kemik yıkama ortamı ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin.

Plakada, iç boşlukları açığa çıkacak şekilde uyluk kemiğinin her iki ucundan 1 milimetre kesin. 26 gauge bir iğnenin boşluklara erişebildiğinden emin olun. Daha sonra, tibia ve uyluk kemiğini diz ekleminden ayırın. Daha sonra, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı iğneyi bir kemik boşluğuna sokun ve kemik iliğini toplayın.

4 kemikten alınan kemik iliğini, 5 mililitre kemik yıkama ortamı ile 50 mililitrelik konik bir tüpe koyun. Ortamı ve iliği birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin veya süspansiyondaki topakları nazikçe dağıtmak için yavaş bir hızda girdap yapın. Kemik iliği dizileri, yarım milimetreden daha kısa küçük ilik lekelerine bölünmelidir.

Daha sonra, tüpü kemik yıkama ortamı ile 50 mililitreye kadar doldurun ve 75 santimetrelik bir doku kültürü şişesine aktarın. Kemik iliğini bir saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında, olgunlaşmış hücreler şişeye yapışacak ve istenen hematopoietik progenitörler süspansiyonda kalacaktır. Süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri bir pelet haline getirin.

Daha sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mililitre MCSF kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, hücre yoğunluğunu mililitre başına 500.000'e ayarlayın ve 30 mililitreyi 75 santimetre karelik yeni bir şişeye yükleyin. Hücreleri kültürlemeye devam edin ve 4, 7 ve 10. günlerde, ters faz kontrastlı parlak alan mikroskobu kullanarak hücrelerin yapıştığını ve hafifçe dallandığını doğrulayın.

Hücreleri kontrol ederken, yapışık olmayan hücreleri içeren ortamı atın. Daha sonra, yapışan hücreleri bir kez IMDM ile yıkayın ve şişeye 30 mililitre taze MSCF kültür ortamı ekleyin. 10. günde, hücreleri toplamak için ortamı 8 mililitre enzim içermeyen EDTA bazlı hücre ayrışma tamponu ile değiştirin. Hücreleri kısa bir süre inkübe edin, ardından hücreleri nazikçe kazıyın ve mikroskop kullanarak serbest bırakıldıklarını doğrulayın.

Hücreler serbest bırakıldıktan sonra, hücrelerle birlikte tamponu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ardından daha fazla hücre toplamak için şişeyi 5 mililitre IMDM ile üç kez durulayın. Tüm koleksiyonları bir araya getirin, santrifüjleyin ve peleti 3 mililitre MCSF'de yeniden süspanse edin. Şimdi, hücreleri sayın ve konsantrasyonlarını mililitrede 1 milyona ayarlayın.

Ardından, 96 oyuklu düz tabanlı bir plakada oyuk başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu plakalayın. Plakanın tamamı doldurulabilir olmalıdır. Hücreleri yapışana kadar yaklaşık bir saat kültürleyin. Daha sonra, IMDM'de hazırlanan farklı LPS konsantrasyonları veya intravenöz immünoglobulin veya her ikisi ile uyarın. Tüm manipülasyonları iki veya üç kopya halinde gerçekleştirin ve tedavi edilmemiş kontrolleri tuttuğunuzdan emin olun, ardından hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin ve süpernatanları analiz edin.