JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 8:18 dk • July 8th, 2025
Aşı kaynaklı bağışıklığı incelemek için, aselüler boğmaca aşısı ile doldurulmuş bir enjeksiyon yapın. Aşı, solunum yolu hastalığına neden olan bir bakteri olan Bordetella pertussis'in antijenik proteinlerini ve sürekli bir bağışıklık tepkisi için antijen maruziyetini uzatan adjuvanları içerir.
Aşıyı anestezi uygulanmış bir fareye kas içine enjekte edin.
Enjeksiyon sonrası, yerleşik antijen sunan hücreler, APC'ler, antijenik proteinleri yakalar ve peptitlere dönüştürür ve bunları yüzeylerinde sunar. Bu APC'ler daha sonra yakındaki lenf düğümlerine göç eder ve T hücreleri ile etkileşime girerek aktivasyonlarını ve efektör T hücrelerine farklılaşmalarını başlatır.
Bu efektör T hücreleri dolaşır ve akciğerler de dahil olmak üzere çeşitli organlara göç eder, burada yerleşik bellek T hücreleri veya TRM hücreleri olarak bulunurlar ve bu da bağışıklamaya yol açar.
Bağışıklama sonrası, intranazal olarak antibiyotiğe dirençli bir canlı Bordetella pertussis suşu uygulayın. Bu bakteriler akciğer dokusuna girer ve TRM hücrelerini aktive eder. Aktive edilmiş TRM hücreleri, bakteri klerensine neden olmak için bağışıklık hücrelerini işe alan inflamatuar sitokinler salgılar.
Farenin akciğer dokusunu hasat edin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için homojenize edin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu antibiyotik içeren bir agar plakasına yayın ve bakteri kolonisi oluşumuna izin vermek için inkübe edin.
Aşılanmış bir fareden alınan doku ekstraktı, aşılanmamış bir fareye kıyasla daha az koloni sergiler ve Bordetella pertussis'e karşı aşı kaynaklı bağışıklığı doğrular.
Bağışıklama için, anestezi uygulanmış 6 ila 12 haftalık bir farede ayak parmağının sıkıştırılmasına yanıt verilmediğini doğrulayın ve ilgilenilen aşının 0,1 mililitresi ile 28,5 gauge iğne ile donatılmış 1 mililitrelik bir insülin şırıngası yükleyin. Şırıngayı, eğim yukarı bakacak şekilde 45 derecelik bir açıyla tutarak, iğneyi farenin deltoidine yaklaşık 5 milimetre sokun ve aşıyı enjekte edin.
İğneyi kas içine sokulmuş halde 5 ila 10 saniye tutun. Ardından, bir sızdırmazlık oluşturmak ve iğneyi enjeksiyon bölgesinden yavaşça geri çekmeden önce aşı sızıntısını önlemek için eğim aşağı bakacak şekilde şırıngayı 180 derece döndürün. Ardından, tam iyileşme sağlanana kadar fareyi izleme ile kafesine geri koyun.
Takviyeden yaklaşık iki hafta sonra, aşılanmış fareleri enfekte edin. Anestezi uygulanmış bir fareyi, omuz bıçaklarının ve boynun arkasındaki dorsal göğüs kafesinin tırnağından kavrayın ve buruna erişmek için fareyi dik olarak konumlandırın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, hayvanın her katmanına 20 ila 25 mikrolitre bakteri aşısını yavaşça uygulayın ve tüm aşı solunana kadar fareyi tutun. Ardından, negatif kontrol olarak bir grup fareye eşit miktarda steril PBS verin.
Uygun deneysel bitiş noktasında, enfekte olmuş bir fare ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve uzuvları sabitleyin. Vücudu% 70 etanol ile ıslatın ve pelvisin ortasındaki karnın altındaki cildi sıkmak için forseps kullanın. Keskin bir makas kullanarak, mandibulaya kadar dikey bir kesim yapın ve cildi periton duvarından çıkarın. Steril organ hasadı için engelsiz bir alan oluşturmak için cildi karkasın yanlarına doğru hareket ettirin ve göğüs kafesinin altındaki sağlam peritonu karaciğerde veya yakınında kavrayın. Alt sindirim sistemini ortaya çıkarmak için peritonu göğüs kafesine doğru kesin ve dalağı ortaya çıkarmak için kolonu sola doğru hareket ettirin.
Kavisli forseps kullanarak dalağı kavrayın ve bağ dokusunu makasla inceleyin. Daha sonra dalağı 3 mililitre RPMI ve% 5 fetal sığır serumu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe buz üzerine yerleştirin. Ksifoid işleminde göğüs kafesini stabilize etmek için forseps kullanın ve diyaframı kesin. Akciğerler sönmeli ve omurgaya doğru düşmelidir.
Göğüs plakasını çıkarmak için göğüs kafesini yanlardan kesin ve sağ akciğerin üst lobunu izole etmek ve çıkarmak için pulmoner arterleri ve damarları kesin. Lob'u en az 24 saat oda sıcaklığında% 10 nötr tamponlu formalin içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe sabitleyin ve sağ ve sol akciğerlerin kalan loblarını izole edin. Ardından, lobları buz üzerinde PBS'de 2 mililitre% 1 kazein içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.
Göğüs boşluğunu dolduran kanı toplamak için uçlu 1 mililitrelik bir PİMİÖĞRETİCİ kullanın ve kanı buz üzerinde önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Parotis, dil altı ve alt çene bezlerini ve soluk borusunu kaplayan lenf bezlerini çıkarın ve soluk borusunu çevreleyen koruyucu zarları açın ve çıkarın. İnce forseps ve makas kullanarak, trakeayı yemek borusundan ve köprücük kemiklerinin üstünden mandibulanın altına kadar diğer bağ dokularını dikkatlice ayırın.
Trakeayı tutmak için forseps kullanın ve trakeayı klavikulanın üst kısmından kesin. Elastikiyeti en üst düzeye çıkarmak için trakeayı aşağı çekin ve mandibulanın alt kısmındaki trakeayı gırtlağın hemen üzerinde kesin ve yaklaşık 1 santimetre dokuyu izole edin. Daha sonra organı, buz üzerinde PBS'de 0,3 mililitre% 1 kazein içeren önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Şimdi, buruna net erişim için fareyi çevirin ve kafaya% 70 etanol püskürtün. Manuel olarak, hayvanı doğrudan kafatasının arkasından kavrayın ve burnun altından başlayıp yukarı doğru hareket ederek burnun yumuşak etini kesmek için makas kullanın. Burun çevresindeki kürkü, deriyi ve bıyıkları çıkarın ve kavisli bir makasın uçlarını, eğrileri aşağı bakacak şekilde burun deliklerine sokun.
Burun pasajını gözlere doğru keserek açın ve V benzeri bir oluşum oluşturun. Daha sonra, nazal septumu ve oluşum içindeki yumuşak dokuyu toplamak için ince forseps kullanın ve dokuyu buz üzerinde PBS'de 0.3 mililitre% 1 kazein içeren önceden etiketlenmiş 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Akciğer dokusunu işlemek için, tüm akciğer numune tüpü içeriğini steril bir 15 mililitrelik dounce homojenizatöre aktarın ve dokuyu homojenize etmek için bir havaneli kullanın. Numuneyi büyük doku parçacıkları kalmayana kadar ayırın ve homojenize süspansiyonu orijinal 15 mililitrelik tüpe geri koyun. Koloni oluşturan birimleri kaplamak için 0,3 mililitrelik bir alikotu çıkarın ve homojenatın geri kalanını santrifüjleme ile toplayın.
ELISA ile sitokin ekspresyon analizine kadar eksi 20 santigrat derecede saklanmak üzere süpernatanın 0.5 mililitresini önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine alın. Daha sonra, bir kenara bırakılmış homojenize akciğer süspansiyonunun 0.1 mililitrelik alikotunu seyreltme başına 0.9 mililitre steril PBS içinde seri olarak seyreltin ve ampirik olarak seçilen her seyreltmenin 0.1 mililitresini önceden etiketlenmiş %10 Bordet-Gengou artı streptomisin plakalarına plakalamak için steril bir üçgen yayıcı kullanın.