Antijen Kaplı Boncuklarla Aktivasyon Sonrası B Lenfositlerinde Organel Dinamiği

B lenfositleri üzerindeki B hücre reseptörleri, BCR'ler, antijenleri bağlayarak hücre aktivasyonuna neden olur. Bu, etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturmak için yardımcı T lenfositlerine sunum için sınıf II MHC moleküllerine yüklenen peptit fragmanlarına işlenmek üzere antijen içselleştirilmesine yol açar.

Antijen kaplı boncuklar kullanarak in vitro B lenfosit aktivasyonunu incelemek için önce antijen kaplı boncuklar elde edin. Bu boncuklar, BCR'lere özgü antijenler, ligandlar ile kovalent olarak kaplanır; reaktif olmayan bir protein, bağlanmamış boncuk bölgelerini bloke ederek spesifik olmayan B lenfosit bağlanmasını önler.

Boncukları B lenfosit süspansiyonuna ekleyin. Karışımı poli-L-lizin kaplı bir lamel üzerine tohumlayın.

Negatif yüklü B lenfositleri, pozitif yüklü lamellere bağlanarak hücreleri hareketsiz hale getirir. Ayrıca, boncukların antijenleri spesifik olarak BCR'lere bağlanır. BCR'nin antijen ile etkileşimi, B lenfositlerini aktive eder ve sıkı bir bağlantı oluşturur - bir bağışıklık sinapsı.

Etkileşim, hücre içi sinyal yollarını başlatarak aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine neden olur. Bu, hücre zarının yayılmasına ve ardından kasılmaya neden olur, bu sırada BCR-antijen mikrokümesi immün sinaps merkezinde yoğunlaşır.

Aktin yeniden şekillenmesinde, bir mikrotübül düzenleme merkezi olan sentrozom, sinapsın yakınında yeniden konumlanır. Yeniden konumlandırma, antijenleri çıkarmak ve sunmak için lizozomlar ve bağışıklık sinapsının yakınındaki Golgi aygıtı gibi organelleri işe alır.

Antijen kaplı boncuklar, amino gruplarını aktive etmek için daha önce glutaraldehit ile muamele edilmiş amino boncuklarla spesifik ligandların inkübe edilmesiyle hazırlanır. Aktif boncukları 100 mikrolitre PBS ve girdapta yeniden askıya alın. Bu arada, 150 mikrolitre PBS'ye ml başına 100 mikrogram BCR ligandı ekleyerek antijen çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, antijen çözeltisine 50 mikrolitre aktif boncuk ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Unutmayın, negatif kontrol olarak ilgili olmayan bir ligand da kullanın. İnkübasyondan sonra, boncuğu PBS ile yıkayın, süpernatanı aspire edin ve PBS ile değiştirin. Üç kez tekrarlayın. Daha sonra, 500 mikrolitrelik bir BSA çözeltisinde boncukları yeniden süspanse ederek serbest amino gruplarını bloke edin. Son olarak, boncukları 70 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın.

Nihai konsantrasyonu hesaplamak için, boncukları saymak için bir hemositometre kullanabilirsiniz. B hücresi aktivasyonu için, 50 ml'lik bir tüp kullanın ve% 5 fetal sığır serumu ile desteklenmiş CLICK'te ml başına 1,5 milyon konsantrasyona hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, 100 mikrolitre hücre-boncuk karışımına karşılık gelen 150.000 B hücresini, poli-L-lizin kaplı bir lamele ekleyin ve farklı zaman noktaları için 37 derecede inkübe edin.