JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:27 dk • July 8th, 2025
Osteoklastogenez, osteoklast öncülerinin farklılaştığı ve çok çekirdekli osteoklastlar oluşturmak için kaynaştığı süreçtir.
Anti-c-fms antikorunun in vitro osteoklastogenez üzerindeki etkisini incelemek için, bir fare kemik iliği hücresi süspansiyonu içeren bir kültür plakası alın. Makrofaj koloni uyarıcı faktör, M-CSF ekleyin.
Kültürde, M-CSF, miyeloid öncü hücreler üzerindeki spesifik reseptörü c-fms'ye bağlanır, sinyal yollarını aktive eder ve osteoklast öncülerini temsil eden ve plakaya yapışan kemik iliği makrofajlarına, BMM'lere farklılaşmaya neden olur.
Yapışmayan hücreleri çıkarın. BMM'leri hasat edin ve çok kuyulu plaka kuyularına tohumlayın. M-CSF ve nükleer faktör kappa-Β ligandının reseptör aktivatörü, RANKL ile takviye
.Kuyucuklara artan anti-c-fms antikor konsantrasyonları ekleyin.
Kontrol kuyusunda, M-CSF, c-fms reseptörlerine bağlanır ve sinyal yollarını aktive eder, RANK reseptör ekspresyonunu uyarır ve BMM sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik eder. RANKL, RANK reseptörlerine bağlanır, bir sinyal kaskadını tetikler ve BMM farklılaşmasına ve osteoklastlara füzyona neden olur.
Daha yüksek antikor konsantrasyonlarına sahip kuyucuklarda, antikorlar c-fms reseptörlerini bağlar ve etkili bir şekilde bloke eder ve osteoklast farklılaşması için gerekli sinyalizasyonu bozar, böylece osteoklast oluşumunu inhibe eder.
Osteoklast popülasyonlarını tanımlamak ve ölçmek için boyama yapın ve RANKL ile indüklenen osteoklast oluşumunda osteoklastogenezi inhibe etmek için etkili antikor konsantrasyonunu belirleyin.
10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitrede 10 milyon hücre tohumlayın ve hücrelere M-CSF ekleyin. Kültürü 3 gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ortamı üç gün sonra çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez kuvvetlice yıkayın.
PBS'ye 5 mililitre oda sıcaklığında% 0.02 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 5 dakika inkübe edin. Hücreleri ayırmak için iyice pipetleyin. Hücrelerin ayrıldığından ve ortamda yuvarlak ve yüzer göründüğünden emin olmak için kültürü mikroskop altında gözlemleyin.
Hücreler ayrıldığında, 5 mililitre alfa-MEM ekleyerek reaksiyonu etkisiz hale getirin. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, 5 mililitre alfa-MEM ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da tekrar santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre alfa-MEM içinde yeniden süspanse edin.
10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitrede 1 milyon hücre tohumlayın ve M-CSF ekleyin. Kültürü 3 gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. 3 gün sonra BMM'leri osteoklast öncüleri olarak temsil eden bağlı hücreleri hasat edin. Oyuk başına 96 oyuklu bir plakada 200 mikrolitre alfa-MEM başına 50.000 hücrede tohum BMM'leri.
Her bir oyuğa istenen uyaranları ekleyin ve ardından mililitre başına 100 nanogramlık bir nihai konsantrasyon için M-CSF ekleyin. Her oyuğa anti-c-fms antikoru ekleyin. Plakayı 4 gün boyunca 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte inkübe ederken, 4 gün boyunca her gün ortam değiştirirken ve ardından el yazmasında anlatıldığı gibi boyama ve tahlillere devam edin.