Yetişkin Sineklerde Konak-Virüs Etkileşimlerini İncelemek için İntratorasik Viral Nano Enjeksiyon

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 3:52 dk • July 8th, 2025

Anestezi uygulanmış vahşi tip ve Dicer-2 mutant erkek Drosophila'yı stereomikroskop altında bir enjeksiyon kabına alın. Sineklerin RNA virüsü replikasyonunu baskılayan herhangi bir simbiyotik bakteri içermediğinden emin olun.

Sinekleri, pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsü süspansiyonu içeren bir nano enjektör ile göğüs içi olarak aşılayın.

Virüs, reseptör aracılı endositoz yoluyla konakçı hücreye girer ve çift sarmallı ara RNA üreterek çoğalır. Konak örüntü tanıma reseptörü Dicer-2, viral çift sarmallı RNA'yı küçük enterferans yapan RNA'lara, siRNA'lara işler.

siRNA, tamamlayıcı zincirinin çıkarıldığı RNA kaynaklı susturma kompleksi RISC'ye bağlanır. RISC yüklü siRNA'lar, tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla diğer viral RNA'lara bağlanarak viral RNA bozulmasına ve gen susturulmasına neden olur.

Dicer-2 ve viral RNA etkileşimi, antiviral proteinler üreterek aşağı akış antiviral sinyal kaskadlarını aktive eder. Bu antiviral proteinler, komşu konakçı hücrelerin Janus kinaz veya JAK, proteine bağlı sitokin reseptörleri ile etkileşime girerek reseptör dimerizasyonunu ve JAK fosforilasyonunu başlatır.

Aktive edilmiş JAK'lar, bir sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü olan STAT proteinlerini fosforile eder ve aktive eder. Aktive edilmiş STAT'lar çekirdeğe translokasyon yapar ve spesifik DNA dizilerine bağlanarak antiviral yanıt genlerinin transkripsiyonunu başlatır.

İstenilen bir süre boyunca sinekleri büyütün.

Aşağı akış analizi, Dicer-2 mutant sineklerinde hayatta kalma oranının azaldığını ve viral yükün arttığını göstermektedir.

Viral enfeksiyon için, önce bir cam kılcal iğnenin ucunu nano enjeksiyon için uygun çapa kırmak için bir stereomikroskop ve ince forseps kullanın. Enjektörü monte etmek için, sızdırmazlık O-ringini ve beyaz bir ara parçası, büyük çukur dışa bakacak şekilde enjektörün metal pistonuna yerleştirin.

Cam iğneyi mineral yağ ile doldurmak için 30 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga kullanın ve iğneyi bileziğin içinden geçirin. Daha büyük O-ringi, iğnenin kör ucundan yaklaşık 1 milimetre uzakta, bileziğin tabanının etrafına yerleştirin ve iğneyi enjektörün pistonuna monte edin.

İğneyi pistona sabitleyin ve sesli bir sinyal duyulana kadar mikro enjektörün pistonunu uzatmak için boş düğmeye basın. Şimdi pistonu 5 milimetre geri çekmek için Doldur'a basın ve iğneyi 100 plak oluşturan birim viral süspansiyona batırın. 20 Wolbachia içermeyen erkek Drosophila'nın bir veya en az üç şişesini enjeksiyon kabına hafifçe sallayın.

Çiftleşme ve üreme sırasındaki hormonal varyasyon dişilerle okumayı etkileyebileceğinden, erkek donanımlı sinekler tercih edilir.

Daha sonra, her bir sineğin göğüs kafesine, mezopleura ve tetraplevra arasındaki hafif daha açık renkli bölgeye 50.6 nanolitre virüs çözeltisi enjekte edin ve DCV yükünü, az önce gösterildiği gibi yer sineklerinden sitopatik etki tahlili ve kantitatif RT-PCR ile ölçün. Enjeksiyondan sonra, sinekleri dikkatlice taze bir şişeye aktarın ve anesteziden kurtulurken sineklerin ortama yapışmasını önlemek için şişeyi yatay bir konuma yerleştirin.

09:32

Bakteriyel enfeksiyon ve atma Drosophila melanogaster içinde sözlü

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:06

Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:16

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:20

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:23

Yetişkin Drosophila Sineklerinin Enjeksiyonu: Bir Bileşik veya Etiket Dağıtım Yöntemi

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:37

Nanoenjektör Kullanarak Sinekleri Bakteriyel Süspansiyonla Enfekte Etmek

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:49

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:07

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:02

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:01

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026