DSS'nin Neden Olduğu Kolitte Kolon Hasarını Değerlendirmek için Hematoksilen ve Eozin Boyama

Dekstran sülfat sodyum veya DSS, bağırsak epitel bariyeri bozulmasının iltihaplanmaya yol açtığı inflamatuar bir bağırsak hastalığı olan koliti indükler.

Doku hasarını değerlendirmek için, DSS'nin neden olduğu kolitin bir murin modelinden izole edilen sabit kolon dokusunu alın. Kolay kesitleme için dokuyu bir gömme ortamına daldırın ve hızla dondurun.

Bir kriyo-mikrotom kullanarak ince bir doku kesiti elde edin ve bunu bir cam slayt üzerinde toplayın.

Slaytı, boyaya pozitif bir yük veren mordana bağlı oksitlenmiş Hematoksilen boyası içeren bir çözeltiye - bir metal katyonu - batırın. Boya-mordan kompleksi, negatif yüklü DNA'ya bağlanarak çekirdeği kırmızımsı-mor renkte boyar.

Dokuyu farklılaştırıcı bir asit-alkol çözeltisine batırın, spesifik olarak bağlı olmayan boyayı sitoplazmadan ve hücre dışı matristen çıkarın. Dokuyu bir mavileştirme ajanı - alkali bir ortam - ile durulayın ve çekirdeğe mavi bir renk vererek kontrastı artırın.

Dokuyu kurutmak için slaydı artan alkol konsantrasyonlarına daldırın ve karşı leke penetrasyonunu artırın.

Dokuyu karşı lekeye batırın - asidik eozin çözeltisi - bazik sitoplazmik proteinlere ve hücre dışı matrise pembe renk verir. Fazla eozini çıkarmak için slaytı alkolle yıkayın. Daha iyi mikroskobik inceleme için dokuyu şeffaf hale getirmek için dokuyu ksilene batırın.

Mikroskop altında, kolon bölümü, DSS'nin neden olduğu koliti gösteren ağırlaştırılmış doku hasarını gösterir.

İzole edilmiş kolon dokusunun hematoksilen ve eozin boyaması için, ertesi sabah, doku parçalarını, numunelerin kriyo-koruması için ayrı ayrı 15 mililitrelik tüplerde gece boyunca PBS'de% 30 sükroz içine daldırın. Ertesi gün, dokuları optimum kesme sıcaklığına veya OCT bileşiğine gömün ve OCT sertleşene kadar dokuları eksi 20 santigrat derecede soğutun.

OCT bloklarını bir kriyostata yerleştirin ve kalınlık kadranını 12 mikrometreye ayarlayın, ardından 12 mikrometre kalınlığındaki donmuş bölümleri dilimleyin ve cam mikroskop slaytlarına toplayın. Tüm dokular kesitlere ayrıldığında, slaytları sıcak bir plaka üzerinde 65 santigrat derecede 20 dakika ısıtın ve ısıtılmış bölümleri hematoksilen boyama solüsyonu ile 5 dakika boyunca boyamadan önce damıtılmış suda kısa bir süre yıkayın.

Fazla hematoksilen çözeltisini 5 dakika boyunca akan musluk suyunda çıkarın ve bölümleri 30 saniye boyunca etanol içinde% 0.5 hidroklorik asit ile ayırt edin, ardından akan musluk suyu altında 1 dakikalık bir durulama yapın. Daha sonra, numuneleri PBS'de 1 dakika yıkayın, ardından akan musluk suyu altında 5 dakika daha yıkayın.

Yıkamanın sonunda, dokuları daldırma başına 10 saniye boyunca artan bir etanol serisine batırın, ardından 2 dakika boyunca eozin içinde karşı boyama yapın. Numunelerin dehidrasyonu için, slaytları daldırma başına 5 dakika boyunca %95 etanol ve 2 değişiklik %100 etanole batırın, ardından ksilen içinde 5 dakikalık iki değişiklikle temizleyin. Ardından, her deney grubunun proksimal, orta ve distal kolonlarındaki doku hasarını puanlayın.