Staphylococcus aureus ile İn Vitro Biyofilm Sentezi

Bakteriyel biyofilmler, konakçı bağışıklık tepkisinden kaçan, kendi kendine üretilen hücre dışı bir matrise gömülü bakteri topluluklarından oluşan üç boyutlu yapılardır.

İn vitro Staphylococcus aureus biyofilm hazırlığı için, istenen hücre yoğunluğuna sahip aktif olarak büyüyen bir Staphylococcus aureus süspansiyonunu çok kuyulu bir plakanın poli-L-lizin kaplı kuyucuklarına aktarın.

Statik koşullar altında inkübasyon sırasında, pozitif yüklü poli-L-lizin kaplama, bakteri yüzeyindeki teikoik asitler gibi negatif yüklü glikopolimerler ile elektrostatik etkileşimleri kolaylaştırarak bakteri bağlanmasını teşvik eder.

Mevcut besin kaynakları ile Staphylococcus aureus bölünür ve birikerek mikro koloniler oluşturur. Ek olarak, bakteriler, hücreleri kaplayan ve bakteriyel kohezyonu ve yüzey yapışmasını destekleyen polisakkaritler, proteinler ve hücre dışı DNA içeren hücre dışı bir matris salgılar.

Devam eden hücre bölünmesi ve matris salgılanması ile biyofilm, hücreden hücreye iletişim için verimli sinyal molekülü dağılımı ile üç boyutlu bir yapıya olgunlaşır.

Eşik bakteri yoğunluğuna ulaştıktan sonra, Staphylococcus aureus proteazları ve nükleazları salgılar, biyofilm matrisini bozar ve ortama birkaç Staphylococcus aureus salgılar. Serbest yüzen, planktonik bakteri içeren ortamı çıkarın.

Biyofilm bozulmasını önlemek için yavaşça bir tampon ekleyin. Kalan bağlanmamış bakterileri içeren tamponu çıkarın.

Üretilen biyofilm, sonraki deneyler için hazırdır.

Triptik soya agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde bir çizgi plakası tekniği kullanarak dondurularak saklanmış bir stoktan izole edilmiş Staphylococcus aureus kolonileri elde ederek başlayın. 96 oyuklu bir plakanın tek tek kuyularını steril suda seyreltilmiş 100 mikrolitre PLL ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Vakum yardımlı bir aspirasyon tuzağı kullanarak PLL solüsyonunu aseptik olarak aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.

% 2 glikoz ile desteklenmiş MEM-alfa içinde bir S. aureus kolonisini aşılayarak bir gece kültürü hazırlayın ve dakikada 200 dönüşte 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. % 2 glikoz ile desteklenmiş 50 mikrolitreyi 5 mililitre taze MEM-alfa'ya aktararak gece boyunca kültürü seyreltin. Ardından, orta logaritmik faz elde edilene kadar dakikada 200 dönüşte 37 santigrat derecede inkübe edin. Orta logaritmik kültürü 0,1'lik bir OD'ye normalleştirmek için MEM-alfa kullanın.

PLL ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 mikrolitre normalleştirilmiş kültür aktarın. Plakayı nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 18 ila 20 saat inkübe edin. Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatanı aspire edin. Nazikçe, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 mikrolitre HBSS ile yıkayın. Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için en az iki kez tekrarlayın.