JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:23 dk • July 8th, 2025
Patojenik bir bakteri olan Haemophilus influenzae yoluyla lenfositleri uyarmak için, lenfositler ve antijen sunan hücreler veya APC'ler dahil olmak üzere izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinin veya PBMC'lerin bir süspansiyonunu alın.
Bakteriyel bir süspansiyon ekleyin ve fizyolojik sıcaklıkta inkübe edin.
APC'lerdeki örüntü tanıma reseptörleri, bakteri hücrelerinin spesifik bileşenlerine bağlanarak fagositozu tetikler. İçselleştirilmiş bakterileri içeren fagozom, lizozomla birleşerek bakteri bozulmasına ve peptit parçalarına işlenmesine neden olur.
Majör histokompatibilite kompleksi veya MHC molekülleri, peptit fragmanlarına bağlanır ve bunları hücre yüzeyinde antijenler olarak sunar. T lenfositler, T hücresi reseptörü aracılığıyla sunulan antijene bağlanır.
T lenfositleri üzerindeki spesifik yüzey reseptörlerine bağlanan ko-uyarıcı antikorlar ekleyin. Sinerjik bağlanma, T lenfosit sitokin üretimini aktive ederek aşağı akış sinyalini indükler.
T lenfositlerinden sitokin salgılanmasını inhibe etmek ve hücre içi sitokin birikimini kolaylaştırmak için endoplazmik retikulumdan Golgi'ye veziküler protein taşınmasını bloke eden bir Golgi bloke edici bileşik ekleyin.
Hücresel morfolojiyi korumak için bir fiksatif ve hücre zarına nüfuz etmek için deterjan ekleyin. T lenfositlere özgü yüzey belirteçlerine bağlanan antikorlar da dahil olmak üzere floresan etiketli antikorlardan oluşan bir kokteyl ekleyin - hücre yüzeyini etiketleme - ve hücre içi sitokinleri bağlamak için hücre içine nüfuz eden sitokin spesifik antikorlar.
Uyarılmış T lenfositleri tarafından sitokin üretimini gösteren çift floresan hücreleri tespit etmek için akış sitometrisi yapın.
Kontrol ve antijen stimülasyonu için periferik kan örneğini alikotlara bölün. Her iki örneğe de ko-uyarıcı antikorlar ekleyin, daha sonra antijen örneğine tiplendirilemeyen H. influenzae'yi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Daha sonra, Golgi bloke edici ajan Brefeldin A'yı örneklere ekleyin ve beş saat daha inkübe edin. Eritrositleri daha önce gösterildiği gibi parçaladıktan sonra, lökositleri 1 saat boyunca 500 mikrolitre% 1 ila% 2 paraformaldehit kullanarak sabitleyin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın, ardından 15 dakika boyunca 100 mikrolitre% 0.1 saponin ile 1 milyon hücreyi geçirgen hale getirin.
Daha sonra, hücreleri uygun floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın, ardından bir akış sitometresi kullanarak analiz edin. İlgili lenfosit popülasyonlarını geçit yaparak antijene yanıt veren hücrelerin oranını belirleyin. Tüm sitokinlerin analiz edilmesi için uyarılmamış hücreler üzerinde arka plan boyama yapın.