Nötrofiller ve Biyofilm Arasındaki Etkileşimi İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Bir biyofilm, mikrobiyal kökenli hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan bir matris içine gömülü, yüzeye yapışmış bir bakteri topluluğudur.

İmmün hücre-biyofilm etkileşimlerini in vitro olarak incelemek için, fırsatçı bir patojen olan Staphylococcus aureus'un biyofilmini içeren bir kanal içeren bir slayt yapın. Tasarlanmış bakteriler, mikroskobik tespit için bir floresan proteini eksprese eder. Kanal, bakterilere besin sağlamak için ortamla dolu rezervuarlara bağlanır.

Floresan hücre izleme boyası ile etiketlenmiş bir nötrofil süspansiyonu ekleyin. Ortam ayrıca ölü hücrelerin DNA'sını lekeleyen bir etidyum homodimer içerir. Fizyolojik koşullar altında kuluçkaya yatırın.

Nötrofiller üzerindeki örüntü tanıma reseptörleri, bakteriler üzerindeki patojenle ilişkili moleküler modellere bağlanır. Bağlanma, nötrofillerin bakterileri fagositoz haline getirmesine ve hücre dışı reaktif oksijen türleri veya ROS üretmesine neden olarak bakterileri öldürür.

Bağışıklık tepkisinden kaçmak için bakteriler, hücre ölümüne neden olan ROS ve lökosidin toksinini azaltan detoksifiye edici enzimler salgılar. Monomerik lökosidin, nötrofiller üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanır ve bir gözenek oluşturmak için multimerizasyona uğrar, zar bütünlüğünü bozar ve hücreleri öldürür.

Etidyum homodimer, hasarlı hücre zarından girerek ölü hücreleri boyar.

Geniş alanlı bir floresan mikroskobu altında, bakteri hücrelerinin ve nötrofillerin bir alt kümesi ölü görünür ve bu da nötrofil-biyofilm etkileşimini gösterir.

Mikroskopi görüntülemeyi kolaylaştırmak için GFP'yi ifade eden USA300 gibi bir floresan S. aureus suşu kullanın. Nötrofilleri% 5 atmosferik karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir rocker'da 30 dakika boyunca 100 mikromolar BCD ile inkübe edin. Numunelerin karanlıkta inkübe edildiğinden emin olun ve ışığa maruz kalmayı sınırlayın.

Fazla BCD'yi yıkamak için, nötrofilleri 270 RCF'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Nötrofilleri taze HBSS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, nötrofil ve bakteri ölümünü izlemek için BCD ile boyanmış nötrofillere 4 mikromolar final konsantrasyonunda etidyum homodimer-1 ekleyin.

Biyofilmi HBSS ile yıkayın ve mikro slaytlarda büyütülen S. aureus biyofilmine 150 mikrolitre nötrofil ekleyin. Mikro slaytları nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin. Bakteri hücrelerinin sayısı, 18 saatlik biyofilm kaplamadan elde edilen hücre sayılarına dayanacaktır.

Floresan boyalara veya proteinlerin uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen floresan kanalları kullanarak nötrofil biyofilm etkileşimini görüntüleyin.