Tütün Ürünü Preparatlarına Maruz Kalan Periferik Kan Mononükleer Hücreleri Tarafından K562 Hücrelerinin Öldürülmesi

Tümör hücreleri, perforin ve granzimler içeren sitokinleri ve sitolitik granülleri serbest bırakmak için efektör bağışıklık hücrelerini aktive eder. Perforin, tümör hücre zarında gözenekler oluşturarak granülimin hücre içine girişini kolaylaştırır ve apoptozu başlatarak hücre ölümüne neden olur.

İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinin sitolitik fonksiyonunu analiz etmek için, PBMC'ler, tütün ürünü hazırlama, TPP, maruziyeti takiben, artan TPP konsantrasyonlarına sahip çok kuyulu bir plaka alın. Orta içeren bir kuyu kontrol görevi görür.

PBMC askıya alma durumunu ekleyin. TPP'lerin birincil immünosüpresif ajanı olan nikotin, efektör PBMC'lerin nikotinik asetilkolin reseptörlerine bağlanarak proinflamatuar sitokin üretimini aşağı regüle eder.

merkezkaç. TPP içeren süpernatanı çıkarın. Medyadaki PBMC'leri yeniden askıya alın. Kuyucuklara floresan etiketli K562 hücreleri, PBMC efektör hücre sitotoksisitesine karşı artan duyarlılığa sahip insan lösemik hücreleri ekleyin.

Baskılanmış immün yanıtlara sahip TPP ile muamele edilen efektör hücreler, PBMC'nin sitolitik yeteneğini azaltan azalmış perforin ekspresyonu ve sitokin salınımı sergiler.

merkezkaç. Hücreleri bir tampon içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücre geçirimsiz bir floresan boya uygulayın. Boya, hücrelere bozulmuş zarlarla girer ve DNA'yı boyar.

Bir akış sitometresi kullanarak, kuyucuklardaki ölü ve canlı K562 hücrelerinin oranını belirleyin. Kontrolden daha yüksek TPP konsantrasyonlarına sahip kuyucuklardaki ölü K562 hücrelerinin daha düşük bir yüzdesi, TPP ile muamele edilen PBMC'ler tarafından K562 hücresinin öldürülmesinin baskılandığını gösterir.

Az önce gösterildiği gibi, tütün ürünü ile muamele edilmiş PBMC'lerden oluşan bir plaka hazırladıktan sonra, 10 mililitre DPBS'de% 80'lik bir birleşmede hasat edilen bir K562 hücresi kültürünü yıkayın. Peleti 5 mililitre DPBS'de tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın. Daha sonra, 1 mililitre tam ortamda yedinci K562 hücrelerine 1 ila 2 kez 10 kez 1 mililitre taze hazırlanmış CFSE çalışma çözeltisi ekleyin ve hücre lekesini girdaplama ile dağıtın.

Hücreleri oda sıcaklığında inkübe edin. Tam olarak 2 dakika sonra, 200 mikrolitre FBS ekleyin ve hücreleri tekrar girdaplayarak iki dakika daha inkübe edin.

İkinci inkübasyondan sonra, hücreleri 10 mililitre tam ortamda yıkayın. Ardından, peleti başka bir 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Şimdi, tütünle muamele edilmiş PBMC'leri santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra kapağı değiştirin, hücreleri girdaplama ile yeniden süspanse edin ve kuyu başına 200 mikrolitre tam ortamda yıkayın.

Öldürme testini başlatmak için, CFSE etiketli K562 hücrelerini PBMC'lere 1 ila 15 oranında ekleyin ve ko-kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.

Beş saat sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın. Peletleri girdaplama ile yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri kuyu başına 200 mikrolitre çalışma tamponu ile yıkayın. Ardından, kuyu başına toplam 100 mikrolitre hacim için 95 mikrolitre çalışma tamponu ve ardından 5 mikrolitre 7-AAD ekleyin.

Son olarak, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre çalışan tampon ekleyin ve 7-AAD ve CFSE pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için tüm hacmi uygun karşılık gelen FACS tüplerine aktarın.