JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:33 dk. • July 8th, 2025
Canlı bakterileri ölçmek için koloni oluşturan birime veya CFU tahliline başlamak için, büyüme ortamında kültürlenmiş makrofajlar içeren çok kuyulu bir plaka alın. Makrofajları, hücre içi büyüme yeteneğine sahip patojenik bir bakteri olan Listeria monocytogenes ile enfekte edin.
Enfeksiyon sırasında, makrofajlar bakterileri yutar ve bakterileri zara bağlı bir bölme - bir fagozom içinde içselleştirir.
Bakteriler gözenek oluşturan bir toksin salgılar ve fagozomal zarı bozar. Böylece bakterilerin sitozole girmesine ve makrofajlar içinde çoğalmasına izin verilir.
Enfekte makrofajları, hücre içi bakterileri korurken içselleştirilmemiş bakterileri seçici olarak ortadan kaldıran bir antibiyotik olan gentamisin ile kısaca tedavi edin.
Antibiyotik içeren üstteki ortamı aspire edin. Daha sonra, enfekte makrofajların üzerine steril damıtılmış su ekleyin ve hipotonik bir ortam yaratın. Bu, su moleküllerinin hücrelere girdiği ve makrofaj lizizine neden olduğu ve bakteriler de dahil olmak üzere hücre içi bileşenleri serbest bıraktığı ozmoza yol açar.
Hücre içi bakteri içeren hücre lizatını lizojeni agar plakasına yayın, tek tek bakteri hücrelerinin ayrılmasını teşvik edin ve bağımsız büyümelerini sağlayın. Kuluçka sırasında, canlı bakteriler agar yüzeyinde büyür ve farklı koloniler oluşturur.
Plakadaki kolonileri sayın ve konakçı bağışıklık tepkisinden kaçan ve enfekte makrofajlar içinde başarılı bir şekilde çoğaltılan hücre içi bakterileri temsil eden CFU'yu elde edin.
Hasat etmek için, tabağı hafifçe eğin ve tüm ortamı kuyudan çıkarmak için dikkatlice bir pipet kullanın. Kuyuya 0,5 mililitre damıtılmış steril su ekleyin. 30 saniye sonra, elde edilen su lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.
10 kat ve 100 kat seyreltmeleri hazırlamak için 450 mikrolitre damıtılmış steril suya 4,5 mikrolitre ve 50 mikrolitre su lizatı ekleyin. Kısaca, iyice karıştırmayı sağlamak için girdap. Orijinal 10 kat seyreltilmiş ve 100 kat seyreltilmiş numunelerden 50 mikrolitre lizojeni et suyu agar plakalarına ekleyin ve bir plaka yayıcı kullanarak yayın.
Acil Lm için tahlil yapmak için, tabaktan 10 mikrolitre kaplama ortamını çıkarın ve mikrosantrifüj tüplerinde iki adet 5 mikrolitrelik alikota bölün. Bir alikota 5 mikrolitre DMEM / FCS ekleyin ve kontrol olarak ikinci alikota mililitre gentamisin başına 5 mikrolitre içeren 5 mikrolitre DMEM / FCS ekleyin.
Oda sıcaklığında 5 dakika bekleyin. Her bir alikota 90 mikrolitre damıtılmış steril su ekleyin ve tüpü 10 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Ardından, 50 mikrolitre numuneyi LB agar plakalarına ekleyin ve bir plaka yayıcı kullanarak yayın. Lm kolonilerini saymadan önce plakaları 37 derece inkübatörde iki gün saklayın.