JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:21 dk • July 8th, 2025
Bir makrofaj kültürü içeren çok kuyulu bir plaka alın. Floresan protein eksprese eden Listeria monocytogenes, Lm ile enfekte.
Lm üzerindeki proteinler, spesifik makrofaj reseptörlerine bağlanarak bakterileri bir fagozom içinde içselleştirir. Ek olarak, Lm, fagozom zarını bozan gözenek oluşturan toksinler salgılar, bakterileri sitozole salar, burada çoğalırlar ve konakçı aktin filamentleri ile çevrili olurlar.
Lm üzerindeki aktin düzeneğini indükleyen ActA proteinleri, bakterinin arka ucunda sürekli aktin polimerizasyonunu indükler. Üretilen aktin kuyruklu yıldız kuyruğu, Lm'yi sitozolden iter ve makrofaj hücre zarına nüfuz ederek polimerize aktin zarflı Lm'yi ortama salar.
İnkübasyon sonrası, hücre dışı, aktin bağlı, Lm içeren ortamı bir dizi kuyudan toplayın ve sabitleyin. Lm'yi paraformaldehit kullanarak sabitleyin. Damıtılmış su ekleyin, makrofajları yırtın ve hücre içi Lm'yi serbest bırakın. Hücre içi Lm'yi toplayın ve numuneyi paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
Diğer kuyucuklarda, hücre dışı Lm'yi ortadan kaldırmak için ortamı hücre geçirimsiz gentamisin içeren ortamla değiştirin. Taze medya ile değiştirin ve istenen süre boyunca inkübe edin.
İnkübasyon sonrası, hücre dışı Lm içeren ortamı toplayın ve numuneyi paraformaldehit ile sabitleyin. Hücre içi Lm içeren lizat elde etmek için damıtılmış su kullanın ve numuneyi paraformaldehit ile sabitleyin. Polimerize aktine seçici olarak bağlanan numunelere floresan etiketli falloidin ekleyin.
Bir akış sitometresi kullanarak, numunelerdeki Lm ve aktin bağlayıcı phalloidinden gelen floresan sinyalleri görselleştirin. Enfekte makrofajlardan türetilen hücre dışı ve hücre içi aktine bağlı Lm'yi nicelleştirin.
Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hazırlanan RAW 264.7 hücrelerini mililitre başına 1 x 106 hücre konsantrasyonuna ayarlayın. Numunenin 1 mililitresini 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına ekleyin. Hücreleri, 50 kişilik bir enfeksiyon çokluğuna karşılık gelen hazırlanmış Lm aşısı ile enfekte edin.
Enfeksiyondan 1,5 saat sonra, 500 mikrolitre% 4 PFA ile doldurulmuş 1,5 milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, ilk kuyucuk setinden ortam toplayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre içi Lm toplamak için, her kuyucuğa 1 mililitre damıtılmış steril su ekleyin. 60 saniye sonra, elde edilen su lizatını 500 mikrolitre% 4 PFA içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 10 saniye kuvvetlice girdap haline getirin ve buzun üzerine yerleştirin.
Kalan kuyucuklar için, ortamı çıkarın ve hücre dışı Lm'yi öldürmek için mililitre gentamisin başına 5 mikrogram ile 1 mililitre DMEM / FCS ile değiştirin.
30 dakika sonra, ortamı çıkarın ve gentamisin içermeyen DMEM / FCS ile değiştirin. İki ve dört saat sonra, ikinci ve üçüncü zaman noktaları için lizatlarda ortamı tüplere toplayın ve soğuması için buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri 7 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjleyin.
Bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın. Tüpe 50 mikrolitre% 4 PFA ve 15 mikrolitre phalloidin içeren boyama kokteyli ekleyin ve her bir peleti yeniden süspanse etmek için karıştırın. Tüpleri karanlıkta 4 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mililitre FACS tamponu ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpleri santrifüjde 7 dakika boyunca 10.000 kez g döndürün. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.
Hemen kullanım için, her peleti 400 mikrolitre FACS tamponunda askıya alın. Daha sonraki analizler için saklıyorsanız, tüpe 200 mikrolitre FACS tamponu ve 200 mikrolitre% 4 PFA ekleyin ve askıya almak için karıştırın.