Floresan mikroskobu ile inflamatuar aktivasyonun tespiti

NOD benzeri reseptör P3 veya NLRP3, inflamatuar aktivasyonu tespit etmek için, NLRP3 proteinlerini eksprese eden aktive makrofajlar içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Hücreleri iyonofor ve glisin içeren ortamlarla tedavi edin. İyonoforlar, potasyum iyonu akışını indükleyerek NLRP3 proteinlerini aktive eder ve oligomerize eder. Oligomerize NLRP3, pro-kaspaz-1'in bağlanmasını kolaylaştırarak NLRP3 inflamatuar kompleksini oluşturan adaptör proteinleri işe alır.

İnflamatuarda, yakınlık pro-kaspaz-1 oto-bölünmeyi tetikler, aktif kaspazları serbest bırakır, piroptoz ve nükleer yoğunlaşmayı başlatır. Ek olarak, glisin hücre yapısını stabilize ederek hücre lizizini önler.

Makrofajları, bir kaspaz-1 bağlanma grubu ve bir amino asit dizisi ile bağlanmış bir florofor içeren floresan raportör probları ile tedavi edin. Aktive edilmiş kaspaz-1, probun amino asit dizisini tanır ve kaspaz bağlama grubuna bağlanarak görselleştirilmesini sağlar.

Hücreleri sabitleyin ve çekirdekleri lekelemek için floresan boya ile kaplayın. Floresan mikroskobu altında görüntü.

Mavi yoğunlaştırılmış çekirdeklere ve aktif kaspaz-1'in yeşil floresan odaklarına sahip makrofajları sayın, bu da NLRP3 inflamatuar aktivasyonunu düşündürür.

Cam lameller üzerine ekilen LPS astarlı kemik iliği türevi makrofajlardan ortamı, oyuk başına 5 mikromolar nigerisin ve 5 milimolar glisin ile desteklenmiş 290 mikrolitre DMEM-5 ortamı ile değiştirerek başlayın. 24 oyuklu plakayı, ilk 15 dakikadan sonra 10 mikrolitre 30X FAM-YVAD-FMK ekleyerek, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 60 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri kuyu başına 1 mililitre soğuk PBS ile yıkama başına 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve hücreleri oyuk başına 250 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile 30 dakika boyunca buz üzerinde sabitleyin, ışıktan korunarak, hücreleri son beş dakika boyunca uygun bir floresan nükleer boya ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve her slaytı 7 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ile yükleyin. Her slaytın üzerine bir lamel yerleştirin ve lamelleri oje ile kapatmadan önce montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.

Hücreleri floresan konfokal mikroskopi ile görüntülemek için, işlenmemiş kontrol slaytını mikroskop tablasına yerleştirin ve hücrelere manuel olarak odaklanın. Mikroskop arama tablosu ayarlarını kullanarak, tedavi edilmemiş hücrelerde pozitif prob duruşu gözlenene kadar ofseti ayarlayın.

Daha sonra, nigerisin ile muamele edilmiş bir numune kullanarak, prob boyaması için hem pozitif hem de negatif hücreler içeren bir alanı bulun ve prob kanalının görüntüleme düzlemini en yüksek pozitif boyama yoğunluğuna sahip düzleme ayarlayın. Ardından, yoğunlaştırılmış çekirdeğe sahip hücrelerde odaklar görünene kadar kazancı ayarlayın ve toplam 100X büyütmede slayt başına rastgele seçilen beş alanın görüntülerini elde edin.